Nosiseptör nöronun çeşitli nöropeptitler salgıladığı ve NK hücresinin bu nöropeptitler için reseptörü ifade ettiği göz önüne alındığında, NK hücresi ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirmeye karar verdik. Böyle bir indirgemeci yöntem, nosiseptör nöronun NK hücresinin anti-tümör fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir ve NK hücresinin yaralı nöronların eliminasyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek de ilginç olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Ali Ahmedi olacak.
Doğal katil veya NK hücre izolasyonuna ve kültürüne başlamak için, fare dalağını 500 mikrolitre steril PBS içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın, ardından bir havane kullanarak dalağı homojenleştirin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre steril PBS ile seyreltin ve karışımı 50 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Steril PBS kullanarak filtrelenmiş homojenat hacmini 10 mililitreye yükseltin.
Bir hemositometre kullanarak seyreltilmiş homojenatın 10 mikrolitresindeki hücreleri sayın. Kalan hücreleri 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücreleri 10'da mililitre başına sekizinci hücrelere takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın.
Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak saflaştırın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücresinin saflığını onaylayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 500 G'de beş dakikada santrifüjleme yapın, ardından süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş NK hücrelerini uyarmak için, bu hücreleri IL-2 ve IL-15 takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında yeniden askıya alın.
48 saat boyunca 96 kuyucuklu bir U alt plakasında mililitre başına altıncı NK hücrelerine iki kez 10 kez kültür yapın. NK hücresi stimülasyonundan 24 saat önce, 96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 mikrolitre laminin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.
Ardından, ötenazi faresini tahtaya eğilimli bir konumda sabitleyin. Cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.
Daha sonra kafatasının tabanına ulaşılana kadar her iki taraftaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın. Atlantioksipital eklemdeki omurgayı kesmek için makas kullanın. Ardından, kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.
Dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı intervertebral foraminadaki dorsal kök ganglionuna veya DRG'ye erişmeden önce omuriliği çıkarmak için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. Daha sonra, DRG'leri 10 mililitre buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra hazırlığı oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
Mililitre kollajenaz IV başına bir miligram ve mililitre dispase II başına 2.4 birim içeren 250 mikrolitre PBS ekleyin.Bu DRG'yi hafif ajitasyonla 80 dakika boyunca kollajenaz-dispaz çözeltisi ile inkübe edin. Enzimleri inaktive etmek için, beş mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve çözeltiyi 200 G'de santrifüj edin.Beş dakika sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın ve istenmeyen hücre kaybını önlemek için süpernatantın yaklaşık 100 mikrolitresini bırakın. Daha sonra, hücrelere bir mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve DRG'yi tek bir hücre preparatına nazikçe tritüre etmek için bir pipet tabancası ve azalan boyutlarda üç cam Pasteur pipeti kullanın.
Bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, sığır serum albümini veya BSA'yı steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin ve eksi 20 santigrat derecede bir mililitre alikot saklayın. 15 mililitrelik konik bir tüpte bir BSA gradyanı oluşturmak için, iki mililitre steril PBS ekleyin ve ardından tüpün dibine bir mililitre% 15 BSA çözeltisi yavaşça dağıtın. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.
Bir P200 pipet kullanarak, nöronları içeren üçlü gangliyon süspansiyonunu tüpün yan tarafına gradyana ekleyin. Daha sonra, BSA gradyanını içeren nöronu 200 G'de 12 dakika boyunca santrifüj etmek için hızlanmayı ve yavaşlamayı minimuma ayarlayın.Santrifüjlemeyi takiben, bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre Neurobazal'da yeniden askıya alın. Laminin kaplı düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 10.000 nöron plakası.
Nöronların bağlanmasına izin vermek için, 96 kuyucuklu plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Birlikte kültürlemeye başlamak için, nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın. IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra, NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne kuyu başına beşinci NK hücrelerine 10 ekleyin.
Takviyeli Neurobazal MX'teki hücreleri 37 santigrat derecede birlikte kültüre alın. 48 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın ve dört santigrat derecede 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri bir ila 1.000 seyreltilmiş canlılık boyası eFluor 780 ile dört santigrat derecede 15 dakika boyamadan önce süpernatantı atın.
Hücreleri gösterildiği gibi yıkayın ve santrifüj yapın, ardından hücreler üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca CD 1632 ile muamele edin, ardından hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın. Bir sonraki yıkama ve santrifüjleme döngüsünden sonra, hücreleri BV421, anti-NK-1.1, floresein izotiyosiyanat anti-NKp46 ve fikoeritrin anti-GM-CSF ile 15 dakika boyunca lekeleyin. Bir kez daha, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın, onları santrifüj edin ve süpernatanı atın, ardından hücreleri 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücrelerini immünofenotipleyin.
Tek başına kültürlendiğinde, NK hücreleri bazal granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktör veya GM-CSF ve NKp46 seviyelerini eksprese etti. Nosiseptör sağlam farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde, kapsaisin stimülasyonu GM-CSF'nin NK hücrelerinin ekspresyonunu azalttı. Kapsaisin, nosiseptör ablatlı farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde NK hücre aktivasyonları üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır.
NKp46 seviyesi etkilenmedi. Bu protokoldeki temel adımlar DRG ayrışması ve yalıtımıdır. Buradaki fikir, kabarcık yapmaktan kaçınarak ve doğru boyutta pipet kullanarak maksimum nöronal canlılığı korumaktır.
Protokolden sonra, araştırmacı FACS saflaştırılmış hücrelerdeki transkript değişimini ölçmek için RNA dizilimini veya qPCR'yi kullanabilir veya sitokin veya nöropeptitlerin salgılanmasını ölçmek için ELISA'yı kullanabilir. Bu tür bir etkileşim, NK hücre fonksiyonunun muhtemelen nosiseptör nöron tarafından ayarlandığını ortaya koymaktadır. Ve bu çapraz konuşma, sinir hasarından, bakteriyel ve viral enfeksiyondan, malignitelere kadar uzanan biyolojik süreçlerde önemli olabilir.
