Dado que o neurônio nociceptor secreta vários neuropeptídeos e que a célula NK expressou o receptor para esses neuropeptídeos, decidimos elaborar um método de co-cultura para estudar a interação entre a célula NK e os neurônios nociceptores. Tal método reducionista poderia ser útil para estudar como o neurônio nociceptor controla a função antitumoral da célula NK, e também pode ser interessante estudar como a célula NK controla a eliminação de neurônios lesados. Demonstrando o procedimento estará Ali Ahmadi, um ex-aluno de mestrado do meu laboratório.
Para iniciar o isolamento e a cultura de células natural killer ou NK, colete o baço do rato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PBS estéril e, em seguida, homogeneize o baço usando um pilão. Em seguida, dilua as células com um mililitro de PBS estéril e filtre a mistura através de um filtro de células de 50 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Recarregue o volume de homogeneizado filtrado para 10 mililitros usando PBS estéril.
Conte as células em 10 microlitros do homogeneizado diluído usando um hemocitômetro. Centrifugar as células restantes por cinco minutos a 500 G e remover o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 10 para a oitava célula por mililitro em meio RPMI 1640 suplementado.
Purificar magneticamente as células NK do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo e confirmar a pureza das células NK usando citometria de fluxo. Conte as células usando um hemocitômetro, seguido de centrifugação em cinco minutos a 500 G, em seguida, remova o sobrenadante. Para estimular as células NK peletizadas, ressuspender essas células em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com IL-2 e IL-15.
Cultura duas vezes 10 para a sexta célula NK por mililitro em uma placa de fundo U de 96 poços por 48 horas. 24 horas antes da estimulação das células NK, revestir a placa de 96 poços com 100 microlitros por poço de laminina e incubá-la por 45 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar livre no armário de biossegurança.
Em seguida, prenda o rato eutanasiado na prancha em posição prona. Levante a pele e incite a pele ao longo da coluna dorsal. Corte a articulação lombossacra e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.
Em seguida, separe a coluna cortando os músculos e costelas de ambos os lados na direção craniana até que a base do crânio seja atingida. Use uma tesoura para cortar a coluna vertebral na articulação atlantooccipital. Em seguida, remova o músculo e o tecido adiposo da coluna vertebral.
Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal antes de obter acesso ao gânglio da raiz dorsal ou DRG nos forames intervertebrais conectados à medula espinhal através da raiz dorsal. Em seguida, colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com 10 mililitros de DMEM suplementado a frio. Em seguida, centrifugar a preparação por cinco minutos a 200 G à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
Adicione 250 microlitros de PBS contendo um miligrama por mililitro de colagenase IV e 2,4 unidades por mililitro de dispase II.Incube este DRG com solução de colagenase-dispase por 80 minutos com agitação leve. Para inativar as enzimas, adicione cinco mililitros de meio DMEM suplementado e centrifugar a solução a 200 G.Após cinco minutos, remova suavemente o sobrenadante usando uma pipeta e deixe cerca de 100 microlitros do sobrenadante para evitar a perda celular indesejada. Em seguida, adicione um mililitro de meio DMEM suplementado às células e use uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes para triturar suavemente o DRG em uma única preparação celular.
Enquanto trabalha em um gabinete de biossegurança, diluir a albumina sérica bovina ou BSA em PBS estéril até uma concentração final de 15% e armazenar alíquotas de um mililitro a menos 20 graus Celsius. Para criar um gradiente BSA em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione dois mililitros de PBS estéril e, em seguida, dispense lentamente um mililitro de solução de 15% de BSA na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.
Usando uma pipeta P200, adicione a suspensão de gânglios triturados contendo os neurônios no lado do tubo no gradiente. Em seguida, defina a aceleração e desaceleração no mínimo para centrifugar o neurônio contendo o gradiente BSA por 12 minutos a 200 G.Após a centrifugação, remova todo o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células em 500 microlitros de Neurobasal. Placa de 10.000 neurônios por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços revestida de laminina.
Para permitir a ligação dos neurônios, incube a placa de 96 poços durante a noite a 37 graus Celsius. Para começar a co-cultura, remova lentamente o Neurobasal da cultura de neurônios. Após 48 horas de estimulação com IL-2 e IL-15, ressuspenda as células NK e adicione 10 à quinta célula NK por poço à cultura de neurônios.
Co-cultura das células em MX Neurobasal suplementado a 37 graus Celsius. Após 48 horas, recolher e lavar as células três vezes com PBS e centrifugar-as durante cinco minutos a 500 G a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante antes de corar as células com um a 1 000 corantes de viabilidade diluídos eFluor 780 durante 15 minutos a quatro graus Celsius.
Lavar e centrifugar as células conforme demonstrado, seguido de tratamento com CD 1632 por 15 minutos a quatro graus Celsius para bloquear locais não específicos nas células, seguido de coleta e lavagem das células com PBS três vezes. Após o próximo ciclo de lavagem e centrifugação, core as células com BV421, anti-NK-1.1, isotiocianato de fluoresceína anti-NKp46 e ficoeritrina anti-GM-CSF por 15 minutos. Mais uma vez, colete e lave as células três vezes com PBS, centrifuga-as e descarte o sobrenadante, em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão FACS e imunofenótipo das células NK usando citometria de fluxo.
Quando cultivadas isoladamente, as células NK expressaram níveis basais de fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos ou GM-CSF e NKp46. Quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptores intactos, a estimulação com capsaicina diminuiu a expressão das células NK do GM-CSF. A capsaicina não teve impacto nas ativações das células NK quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos ablados.
O nível de NKp46 não foi afetado. As principais etapas deste protocolo são a dissociação e o isolamento do DRG. A ideia é manter a máxima viabilidade neuronal, evitando fazer bolhas e usando a pipeta do tamanho certo.
Após o protocolo, o investigador pode usar o sequenciamento de RNA ou qPCR para medir a mudança do transcrito em células purificadas com FACS, ou pode usar ELISA para medir a secreção de citocinas ou neuropeptídeos. Tal interação revela que a função das células NK é provavelmente sintonizada pelo neurônio nociceptor. E essa conversa cruzada pode ser importante em processos biológicos que vão desde lesões nervosas, infecções bacterianas e virais, até malignidades.
