Учитывая, что нейроны ноцицептора секретируют различные нейропептиды и что NK-клетка экспрессирует рецептор для этих нейропептидов, мы решили разработать метод кокультуры для изучения взаимодействия между NK-клеткой и нейронами ноцицептора. Такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как нейрон ноцицептора контролирует противоопухолевую функцию NK-клетки, а также может быть интересно изучить, как NK-клетка контролирует устранение поврежденных нейронов. Демонстрировать процедуру будет Али Ахмади, бывший студент магистратуры из моей лаборатории.
Чтобы начать выделение и культивирование естественных киллеров или NK-клеток, соберите селезенку мыши в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 500 микролитров стерильного PBS, затем гомогенизируйте селезенку с помощью пестика. Затем разбавьте клетки одним миллилитром стерильного PBS и фильтруйте смесь через 50-микронный клеточный сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Долить отфильтрованный гомогенатный объем до 10 миллилитров с помощью стерильного PBS.
Подсчитайте клетки в 10 микролитрах разбавленного гомогената с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте оставшиеся клетки в течение пяти минут при 500 G и удалите супернатант. Затем повторно суспендируют клетки от 10 до восьмой клетки на миллилитр в дополненной среде RPMI 1640.
Магнитно очистите NK-клетки селезенки с помощью набора изоляции NK-клеток мыши и подтвердите чистоту NK-клеток с помощью проточной цитометрии. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра с последующим центрифугированием через пять минут при 500 G, затем удалите супернатант. Для стимуляции гранулированных NK-клеток повторно суспендируют эти клетки в культуральной среде IL-2 и IL-15 RPMI 1640.
Культивируйте два раза от 10 до шестого NK-клеток на миллилитр в 96-луночной U-образной нижней пластине в течение 48 часов. За 24 часа до стимуляции NK-клеток покройте 96-луночную пластину 100 микролитрами на лунку ламинина и инкубируйте ее в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия. После инкубации удалите раствор и дайте лункам высохнуть на воздухе в шкафу биобезопасности.
Далее закрепите усыпленную мышь на доске в положении лежа. Подтяните кожу и разрезайте кожу вдоль спинного столба. Отрежьте пояснично-крестцовый сустав и отделите крестец от поясничного отдела позвоночника ножницами.
Затем отделите позвоночник, разрезав мышцы и ребра с обеих сторон в черепном направлении, пока не будет достигнуто основание черепа. Используйте ножницы, чтобы отрезать позвоночник в атлантокципитальном суставе. Далее удаляют мышечную и жировую ткань из позвоночника.
Закрепите и откройте позвоночный столб, чтобы удалить спинной мозг, прежде чем получить доступ к ганглию дорсального корешка или ДРГ в межпозвоночном форамине, соединенном со спинным мозгом через дорсальный корень. Затем соберите DRG в 15-миллилитровую коническую трубку, заполненную 10 миллилитрами ледяного холода, дополненного DMEM. Затем центрифугируют препарат в течение пяти минут при 200 г при комнатной температуре и удаляют надосадочную массу.
Добавьте 250 микролитров PBS, содержащих один миллиграмм на миллилитр коллагеназы IV и 2,4 единицы на миллилитр диспазы II.Инкубируйте эту ДРГ раствором коллагеназы-диспазы в течение 80 минут с легким перемешиванием. Чтобы инактивировать ферменты, добавьте пять миллилитров дополненной среды DMEM и центрифугируйте раствор при 200 г. Через пять минут осторожно удалите супернатант с помощью пипетки и оставьте около 100 микролитров супернатанта, чтобы избежать нежелательной потери клеток. Затем добавьте один миллилитр дополненной среды DMEM в ячейки и используйте пипетку и три стеклянные пипетки Пастера уменьшающихся размеров, чтобы аккуратно тритурировать DRG в одноклеточный препарат.
Во время работы в шкафу биобезопасности разводят бычий сывороточный альбумин или BSA в стерильном PBS до конечной концентрации 15% и хранят один миллилитр аликвоты при минус 20 градусах Цельсия. Чтобы создать градиент BSA в 15-миллилитровой конической трубке, добавьте два миллилитра стерильного PBS, а затем медленно дозируйте один миллилитр 15%-ного раствора BSA в нижней части трубки. Избегайте нарушения градиента, аккуратно удалив пипетку.
Используя пипетку P200, добавьте тритурированную суспензию ганглиев, содержащую нейроны, на стороне трубки в градиент. Затем установите ускорение и замедление на минимуме, чтобы центрифугировать нейрон, содержащий градиент BSA, в течение 12 минут при 200 G. После центрифугирования удалите весь супернатант с помощью пипетки и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах нейробазала. Пластина 10 000 нейронов на лунку в пластине с плоским дном с 96 луночным покрытием.
Чтобы обеспечить прикрепление нейронов, инкубируйте 96-луночную пластину в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Чтобы начать совместное культивирование, медленно удалите нейробазаль из культуры нейронов. После 48 часов стимуляции IL-2 и IL-15 повторно суспендируют NK-клетки и добавляют 10 к пятой NK-клетке на лунку к культуре нейронов.
Совместно культивируйте клетки в дополненном neurobasal MX при 37 градусах Цельсия. Через 48 часов соберите и трижды промывайте клетки PBS и центрифугируйте их в течение пяти минут при 500 G при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта перед окрашиванием клеток от одного до 1000 разбавленного красителя жизнеспособности eFluor 780 в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Промывайте и центрифугируйте клетки, как показано на рисунке, с последующим лечением CD 1632 в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы блокировать неспецифические участки на клетках, с последующим сбором и промывкой клеток PBS трижды. После следующего цикла промывки и центрифугирования окрашивают клетки BV421, анти-NK-1.1, флуоресцеина изотиоцианата анти-NKp46 и фикоэритрина анти-GM-CSF в течение 15 минут. Еще раз соберите и промывайте клетки трижды с помощью PBS, центрифугируйте их и выбрасывайте супернатант, затем повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера FACS и иммунофенотипа NK-клеток с помощью проточной цитометрии.
При культивировании в одиночку NK-клетки экспрессировали базальные уровни гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора или GM-CSF и NKp46. При совместном культивировании с нейронами DRG, собранными у неповрежденных мышей ноцицепторов, стимуляция капсаицином снижала экспрессию NK-клеток GM-CSF. Капсаицин не оказывал влияния на активацию NK-клеток при совместной культивировании с нейронами DRG, собранными у мышей с абляцией ноцицепторов.
Уровень NKp46 не был затронут. Ключевыми шагами в этом протоколе является диссоциация и изоляция DRG. Идея состоит в том, чтобы сохранить максимальную жизнеспособность нейронов, избегая создания пузыря и используя пипетку правильного размера.
После протокола исследователь может использовать секвенирование РНК или qPCR для измерения изменения транскрипта в очищенных клетках FACS, или они могут использовать ИФА для измерения секреции цитокинов или нейропептидов. Такое взаимодействие показывает, что функция NK-клеток, вероятно, настраивается нейроном ноцицептора. И эти перекрестные помехи могут быть важны в биологических процессах, охватывающих от повреждения нервов, бактериальной и вирусной инфекции до злокачественных новообразований.
