Angesichts der Tatsache, dass Nozizeptorneuronen verschiedene Neuropeptide sezernieren und dass NK-Zellen den Rezeptor für diese Neuropeptide exprimieren, haben wir uns entschieden, eine Kokulturmethode zu entwickeln, um das Zusammenspiel zwischen der NK-Zelle und den Nozizeptorneuronen zu untersuchen. Eine solche reduktionistische Methode könnte nützlich sein, um zu untersuchen, wie Nozizeptorneurone die Antitumorfunktion von NK-Zellen kontrollieren, und es könnte auch interessant sein zu untersuchen, wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen kontrollieren. Ali Ahmadi, ein ehemaliger Masterstudent aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Um mit der Isolierung und Kultur des natürlichen Killers oder der NK-Zellen zu beginnen, sammeln Sie die Milz der Maus in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern sterilem PBS und homogenisieren Sie dann die Milz mit einem Stößel. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen mit einem Milliliter sterilem PBS und filtern die Mischung durch ein 50-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Füllen Sie das gefilterte Homogenatvolumen mit sterilem PBS auf 10 Milliliter auf.
Zählen Sie die Zellen in 10 Mikrolitern des verdünnten Homogenats mit einem Hämozytometer. Die restlichen Zellen werden fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend werden die Zellen bei 10 bis acht Zellen pro Milliliter in ergänztem RPMI 1640-Medium resuspendiert.
Reinigen Sie die Milz-NK-Zellen magnetisch mit einem Maus-NK-Zellisolierungskit und bestätigen Sie die NK-Zellreinheit mittels Durchflusszytometrie. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, gefolgt von einer Zentrifugation nach fünf Minuten bei 500 G, dann entfernen Sie den Überstand. Zur Stimulation der pelletierten NK-Zellen resuspendieren Sie diese Zellen in IL-2 und IL-15 ergänztem RPMI 1640 Kulturmedium.
Kultur zweimal 10 bis zur sechsten NK-Zellen pro Milliliter in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 Stunden. 24 Stunden vor der NK-Zellstimulation die 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Laminin pro Welle beschichten und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in der Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.
Als nächstes befestigen Sie die eingeschläferte Maus auf dem Brett in Bauchlage. Heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der dorsalen Säule. Schneiden Sie das lumbosakrale Gelenk ab und trennen Sie das Kreuzbein mit einer Schere von der Lendenwirbelsäule.
Trennen Sie dann die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten in Schädelrichtung schneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist. Verwenden Sie eine Schere, um die Wirbelsäule am Atlantookzipitalgelenk abzuschneiden. Als nächstes entfernen Sie den Muskel und das Fettgewebe von der Wirbelsäule.
Pinnen und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen, bevor Sie Zugang zum dorsalen Wurzelganglion oder DRG in der Zwischenwirbelforamina erhalten, die durch die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden ist. Als nächstes ernten Sie die DRGs in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen, das mit 10 Milliliter eiskalt ergänztem DMEM gefüllt ist. Dann zentrifugieren Sie das Präparat für fünf Minuten bei 200 G bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
Fügen Sie 250 Mikroliter PBS hinzu, die ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV und 2,4 Einheiten pro Milliliter Dispase II enthalten.Inkubieren Sie dieses DRG mit Kollagenase-Dispase-Lösung für 80 Minuten unter leichtem Rühren. Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie fünf Milliliter ergänztes DMEM-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Lösung bei 200 G.Nach fünf Minuten entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und lassen Sie etwa 100 Mikroliter des Überstands stehen, um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie den Zellen ein Milliliter angereichertes DMEM-Medium hinzu und verwenden Sie eine Pipettenpistole und drei Glaspasteurpipetten abnehmender Größe, um das DRG vorsichtig in eine Einzelzellpräparation zu trituieren.
Während der Arbeit in einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin oder BSA in sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 15% verdünnen und einen Milliliter Aliquots bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu erzeugen, fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS hinzu und dosieren Sie dann langsam einen Milliliter 15% BSA-Lösung am Boden des Röhrchens. Vermeiden Sie eine Unterbrechung des Farbverlaufs, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.
Fügen Sie mit einer P200-Pipette die geritrierte Gangliensuspension mit den Neuronen seitlich des Röhrchens in den Farbverlauf ein. Stellen Sie dann die Beschleunigung und Verzögerung auf das Minimum ein, um das Neuron mit dem BSA-Gradienten für 12 Minuten bei 200 G zu zentrifugieren.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den gesamten Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Neurobasal. Platte 10.000 Neuronen pro Vertiefung in einer lamininbeschichteten flachen 96-Well-Platte.
Um die Anheftung der Neuronen zu ermöglichen, inkubieren Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um mit der Co-Kultivierung zu beginnen, entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur. Nach 48 Stunden Stimulation mit IL-2 und IL-15 resuspendieren Sie die NK-Zellen und fügen 10 zu den fünften NK-Zellen pro Vertiefung zur Neuronenkultur hinzu.
Co-Kultur der Zellen in ergänztem Neurobasal MX bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden die Zellen dreimal mit PBS sammeln und waschen und fünf Minuten bei 500 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen mit einem bis 1.000 verdünnten Lebensfähigkeitsfarbstoff eFluor 780 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius färben.
Waschen und zentrifugieren Sie die Zellen wie gezeigt, gefolgt von einer Behandlung mit CD 1632 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um unspezifische Stellen auf den Zellen zu blockieren, gefolgt von einem dreifachen Sammeln und Waschen der Zellen mit PBS. Nach dem nächsten Wasch- und Zentrifugationszyklus färben Sie die Zellen 15 Minuten lang mit BV421, Anti-NK-1.1, Fluorescein-Isothiocyanat-Anti-NKp46 und Phycoerythrin-Anti-GM-CSF an. Noch einmal, sammeln und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, zentrifugieren Sie sie und verwerfen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter FACS-Puffer und Immunphänotyp die NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie.
Wenn sie allein kultiviert wurden, exprimierten NK-Zellen basale Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF und NKp46. Bei Co-Kultivierung mit DRG-Neuronen, die von Nozizeptor-intakten Mäusen geerntet wurden, verringerte die Capsaicin-Stimulation die NK-Zellexpression von GM-CSF. Das Capsaicin hatte keinen Einfluss auf die NK-Zellaktivierungen, wenn es mit DRG-Neuronen aus nozizeptorabgetragenen Mäusen kokultiviert wurde.
Der Spiegel von NKp46 wurde nicht beeinflusst. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die DRG-Dissoziation und -Isolierung. Die Idee ist, die maximale neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten, indem man die Bildung von Blasen vermeidet und die richtige Pipette verwendet.
Nach dem Protokoll kann der Prüfer RNA-Sequenzierung oder qPCR verwenden, um die Transkriptänderung in FACS-gereinigten Zellen zu messen, oder er kann ELISA verwenden, um die Sekretion von Zytokin oder Neuropeptiden zu messen. Ein solches Zusammenspiel zeigt, dass die NK-Zellfunktion wahrscheinlich durch das Nozizeptor-Neuron abgestimmt wird. Und dieses Übersprechen kann in biologischen Prozessen wichtig sein, die von Nervenverletzungen, bakteriellen und viralen Infektionen bis hin zu Malignomen reichen.
