Étant donné que les neurones nocicepteurs sécrètent divers neuropeptides et que les cellules NK expriment le récepteur de ces neuropeptides, nous avons décidé de concevoir une méthode de co-culture pour étudier l’interaction entre la cellule NK et les neurones nocicepteurs. Une telle méthode réductionniste pourrait être utile pour étudier comment les neurones nocicepteurs contrôlent la fonction antitumorale des cellules NK, et il pourrait également être intéressant d’étudier comment les cellules NK contrôlent l’élimination des neurones lésés. La démonstration de la procédure sera faite par Ali Ahmadi, un ancien étudiant en maîtrise de mon laboratoire.
Pour commencer l’isolement et la culture des cellules tueuses naturelles ou NK, recueillir la rate de souris dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS stérile, puis homogénéiser la rate à l’aide d’un pilon. Ensuite, diluez les cellules avec un millilitre de PBS stérile et filtrez le mélange à travers une passoire cellulaire de 50 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Complétez le volume d’homogénat filtré à 10 millilitres en utilisant du PBS stérile.
Compter les cellules dans 10 microlitres de l’homogénat dilué à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules restantes pendant cinq minutes à 500 G et retirer le surnageant. Puis remettre les cellules en suspension à 10 à la huitième cellule par millilitre dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.
Purifiez magnétiquement les cellules NK de la rate à l’aide d’un kit d’isolation de cellules NK de souris et confirmez la pureté des cellules NK à l’aide de la cytométrie en flux. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, suivi d’une centrifugation à cinq minutes à 500 G, puis retirer le surnageant. Pour stimuler les cellules NK granulées, remettre ces cellules en suspension dans un milieu de culture RPMI 1640 supplémenté en IL-2 et IL-15.
Culture deux fois 10 à la sixième cellule NK par millilitre dans une plaque de fond en U de 96 puits pendant 48 heures. 24 heures avant la stimulation des cellules NK, enduisez la plaque de 96 puits de 100 microlitres par puits de laminine et incuberez-la pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirer la solution et laisser sécher les puits à l’air libre dans l’enceinte de biosécurité.
Ensuite, fixez la souris euthanasiée sur le tableau en position couchée. Soulever la peau et inciser la peau le long de la colonne dorsale. Coupez l’articulation lombo-sacrée et séparez le sacrum de la colonne lombaire avec des ciseaux.
Ensuite, séparez la colonne vertébrale en coupant les muscles et les côtes des deux côtés dans le sens crânien jusqu’à ce que la base du crâne soit atteinte. Utilisez des ciseaux pour couper la colonne vertébrale au niveau de l’articulation atlanto-occipitale. Ensuite, retirez le muscle et le tissu adipeux de la colonne vertébrale.
Épinglez et ouvrez la colonne vertébrale pour enlever la moelle épinière avant d’accéder au ganglion de la racine dorsale ou DRG dans le foramina intervertébral relié à la moelle épinière par la racine dorsale. Ensuite, récoltez les DRG dans un tube conique de 15 millilitres rempli de 10 millilitres de DMEM supplémenté par du froid glacé. Centrifuger ensuite la préparation pendant cinq minutes à 200 G à température ambiante et retirer le surnageant.
Ajouter 250 microlitres de PBS contenant un milligramme par millilitre de collagénase IV et 2,4 unités par millilitre de dispase II.Incuber ce DRG avec une solution de collagénase-dispase pendant 80 minutes avec une légère agitation. Pour inactiver les enzymes, ajoutez cinq millilitres de milieu DMEM supplémenté et centrifugez la solution à 200 G.Après cinq minutes, retirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette et laissez environ 100 microlitres du surnageant pour éviter la perte cellulaire indésirable. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu DMEM supplémenté aux cellules et utilisez un pistolet à pipette et trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes pour triturer doucement le DRG en une seule préparation cellulaire.
Pendant que vous travaillez dans une enceinte de biosécurité, diluer l’albumine sérique bovine ou BSA dans du PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 15 % et conserver une aliquote d’un millilitre à moins 20 degrés Celsius. Pour créer un gradient BSA dans un tube conique de 15 millilitres, ajoutez deux millilitres de PBS stérile, puis distribuez lentement un millilitre de solution BSA à 15% au fond du tube. Évitez de perturber le gradient en retirant doucement la pipette.
À l’aide d’une pipette P200, ajouter la suspension ganglionnaire triturée contenant les neurones sur le côté du tube dans le gradient. Réglez ensuite l’accélération et la décélération au minimum pour centrifuger le neurone contenant le gradient BSA pendant 12 minutes à 200 G.Après la centrifugation, retirer tout le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de Neurobasal. Plaque 10 000 neurones par puits dans une plaque à fond plat recouverte de laminine à 96 puits.
Pour permettre la fixation des neurones, incuber la plaque de 96 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour commencer la co-culture, retirez lentement le Neurobasal de la culture neuronale. Après 48 heures de stimulation avec IL-2 et IL-15, remettez en suspension les cellules NK et ajoutez 10 à la cinquième cellule NK par puits à la culture de neurones.
Co-culture des cellules dans Neurobasal MX supplémenté à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, recueillir et laver les cellules trois fois avec du PBS et les centrifuger pendant cinq minutes à 500 G à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant avant de colorer les cellules avec un à 1 000 colorant de viabilité dilué eFluor 780 pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Lavez et centrifugez les cellules comme démontré, puis traitez avec CD 1632 pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour bloquer les sites non spécifiques sur les cellules, puis collectez et lavez les cellules avec du PBS trois fois. Après le prochain cycle de lavage et de centrifugation, colorez les cellules avec BV421, anti-NK-1.1, isothiocyanate de fluorescéine anti-NKp46 et phycoérythrine anti-GM-CSF pendant 15 minutes. Encore une fois, collectez et lavez les cellules trois fois avec du PBS, centrifugez-les et jetez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS et immunophénotype les cellules NK en utilisant la cytométrie de flux.
Lorsqu’elles sont cultivées seules, les cellules NK expriment des niveaux basaux de facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires ou GM-CSF et NKp46. Lorsqu’elle est co-cultivée avec des neurones DRG récoltés sur des souris nociceptrices intactes, la stimulation de la capsaïcine diminue l’expression des cellules NK du GM-CSF. La capsaïcine n’a eu aucun impact sur les activations des cellules NK lorsqu’elle était co-cultivée avec des neurones DRG récoltés sur des souris ablées par nocicepteur.
Le niveau de NKp46 n’a pas été affecté. Les étapes clés de ce protocole sont la dissociation et l’isolement DRG. L’idée est de garder une viabilité neuronale maximale en évitant de faire des bulles et en utilisant la pipette de bonne taille.
Après le protocole, le chercheur peut utiliser le séquençage de l’ARN ou qPCR pour mesurer le changement de transcription dans les cellules purifiées FACS, ou il peut utiliser ELISA pour mesurer la sécrétion de cytokines ou de neuropeptides. Une telle interaction révèle que la fonction des cellules NK est probablement réglée par le neurone nocicepteur. Et cette diaphonie peut être importante dans les processus biologiques allant des lésions nerveuses, des infections bactériennes et virales, jusqu’aux tumeurs malignes.
