侵害受容器ニューロンが様々な神経ペプチドを分泌し、NK細胞がこれらの神経ペプチドの受容体を発現していることから、NK細胞と侵害受容器ニューロンの相互作用を調べるために共培養法を考案することにしました。このような還元主義的手法は、侵害受容器ニューロンがNK細胞の抗腫瘍機能をどのように制御するかを研究するのに有用であり、NK細胞が損傷ニューロンの排除をどのように制御するかを研究することも興味深いかもしれません。手順を実演するのは、私の研究室の元修士課程の学生であるアリ・アフマディです。
ナチュラルキラーまたはNK細胞の単離と培養を開始するには、500マイクロリットルの滅菌PBSを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブにマウスの脾臓を集め、乳棒を使用して脾臓をホモジナイズします。次に、細胞を1ミリリットルの滅菌PBSで希釈し、混合物を50ミクロンのセルストレーナーを通して50ミリリットルのコニカルチューブに濾過する。滅菌PBSを使用して、ろ過したホモジネート容量を10ミリリットルに補充します。
血球計算盤を使用して10マイクロリットルの希釈ホモジネート中の細胞をカウントします。残りの細胞を500Gで5分間遠心分離し、上清を除去します。次いで、細胞を補充したRPMI 1640培地に1ミリリットルあたり10〜8番目の細胞で再懸濁する。
マウスNK細胞分離キットを用いて脾臓NK細胞を磁気精製し、フローサイトメトリーを用いてNK細胞純度を確認する。血球計算盤を用いて細胞をカウントし、続いて500Gで5分間で遠心分離し、次いで上清を除去する。ペレット化したNK細胞を刺激するために、これらの細胞をIL-2およびIL-15補充RPMI 1640培養培地に再懸濁する。
1ミリリットルあたり10〜6番目のNK細胞を96ウェルU底プレートで2回培養し、48時間培養する。NK細胞刺激の24時間前に、96ウェルプレートに1ウェルあたり100マイクロリットルのラミニンをコーティングし、摂氏37度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を取り出し、ウェルをバイオセーフティキャビネット内で風乾させます。
次に、安楽死させたマウスをボード上の腹臥位で固定します。皮膚を持ち上げ、背柱に沿って皮膚を切開します。腰仙関節を切り取り、はさみで仙骨を腰椎から分離します。
次に、頭蓋骨の付け根に達するまで、両側の筋肉と肋骨を頭蓋方向に切断して脊椎を分離します。はさみを使用して、大西洋後頭関節の脊椎を切り落とします。次に、背骨から筋肉と脂肪組織を取り除きます。
脊柱をピン留めして開き、脊髄を除去してから、後根を介して脊髄に接続された椎間孔の背根神経節またはDRGにアクセスします。次に、DRGを10ミリリットルの氷冷補給DMEMで満たされた15ミリリットルの円錐管に収穫します。次いで、調製物を室温で200Gで5分間遠心分離し、上清を除去する。
1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼIVと2.4単位/ミリリットルのディスパーゼIIを含む250マイクロリットルのPBSを加え、このDRGをコラゲナーゼ-ディスパーゼ溶液で80分間、穏やかな攪拌でインキュベートします。酵素を不活性化するには、5ミリリットルの添加DMEM培地を加え、200 Gで溶液を遠心分離します.5分後、ピペットを使用して上清を静かに取り除き、不要な細胞の損失を避けるために約100マイクロリットルの上清を残します。次に、1ミリリットルの添加DMEM培地を細胞に加え、ピペットガンと3つのガラス製パスツールピペットを使用して、DRGを1つの細胞調製物に穏やかに粉砕します。
バイオセーフティキャビネットでの作業中に、ウシ血清アルブミンまたはBSAを滅菌PBSで最終濃度15%に希釈し、摂氏マイナス20度で1ミリリットルのアリコートを保存します。15ミリリットルの円錐形チューブにBSAグラジエントを作成するには、2ミリリットルの滅菌PBSを加え、チューブの底に1ミリリットルの15%BSA溶液をゆっくりと分注します。ピペットをそっと取り外して、勾配を乱さないようにしてください。
P200ピペットを使用して、ニューロンを含む粉砕された神経節懸濁液をチューブの側面に勾配に追加します。次に、加速と減速を最小に設定して、BSA勾配を含むニューロンを200 Gで12分間遠心分離し、遠心分離に続いて、ピペットを使用してすべての上清を取り除き、細胞を500マイクロリットルのNeurobasalに再懸濁します。プレートは1ウェルあたり10,000ニューロンをラミニンコーティング平底96ウェルプレートに。
ニューロンの付着を可能にするために、96ウェルプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。共培養を開始するには、ニューロン培養からニューロベースをゆっくりと取り除きます。IL-2およびIL-15で48時間刺激した後、NK細胞を再懸濁し、ニューロン培養液に1ウェルあたり10〜5番目のNK細胞を追加します。
補充したニューロバクサルMXで細胞を摂氏37度で共培養します。48時間後、細胞を集めてPBSで3回洗浄し、摂氏4度で500Gで5分間遠心分離します。細胞を1〜1,000希釈生存率色素eFluor 780で摂氏4度で15分間染色する前に、上清を廃棄します。
実証されたように細胞を洗浄および遠心分離し、続いてCD 1632で摂氏4度で15分間処理して細胞上の非特異的部位をブロックし、続いて細胞を回収してPBSで3回洗浄する。洗浄と遠心分離の次のサイクルの後、細胞をBV421、抗NK-1.1、フルオレセインイソチオシアネート抗NKp46、およびフィコエリスリン抗GM-CSFで15分間染色します。もう一度、細胞を集めてPBSで3回洗浄し、遠心分離して上清を捨ててから、細胞を500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを使用してNK細胞の免疫表現型を決定します。
単独で培養した場合、NK細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。侵害受容器インタクトマウスから採取したDRGニューロンと共培養した場合、カプサイシン刺激はNK細胞のGM-CSFの発現を低下させた。カプサイシンは、侵害受容器切除マウスから採取したDRGニューロンと共培養した場合、NK細胞の活性化に影響を与えませんでした。
NKp46のレベルは影響を受けませんでした。このプロトコルの重要なステップは、DRGの解離と分離です。アイデアは、気泡の発生を避け、適切なサイズのピペットを使用することにより、ニューロンの生存率を最大限に高めることです。
プロトコル後、研究者はRNAシーケンシングまたはqPCRを使用してFACS精製細胞の転写産物の変化を測定するか、ELISAを使用してサイトカインまたは神経ペプチドの分泌を測定することができます。このような相互作用は、NK細胞の機能が侵害受容器ニューロンによって調整されている可能性が高いことを明らかにしています。そして、このクロストークは、神経損傷、細菌およびウイルス感染から悪性腫瘍に至るまでの生物学的プロセスにおいて重要である可能性があります。
