我们技术的主要优点是，它是一种简单、快速且可重复的方法，用于编辑小鼠原代肝细胞中的基因，作为生成体外和体内疾病模型的一种方式。使用我们的技术，有可能敲低分离的肝细胞中的靶基因，然后将其移植回患者体内，用基因编辑的肝细胞替换患病细胞 缺乏经验的研究人员可能会在整个灌注过程中难以插管并保持导管稳定。建议用户在开始之前仔细阅读并练习该过程和故障排除方法。
展示肝脏灌注和肝细胞分离的将是临床设施经理Tina Parker和研究生研究助理Ilayda Ates。电穿孔程序将由我实验室的研究生研究助理Callie Stuart演示。在麻醉的手术平面下。
通过使用剪刀在腹部皮肤上做一个U形横向切口开始肝脏灌注，并通过侧面扩大孔。继续打开肋骨的皮肤。用剪刀切开腹膜，将腹腔暴露到胸腔。
小心不要切伤任何器官。使用镊子的背面或剪刀的钝面将肠子向右侧移动。识别门静脉和下腔静脉。
启动泵以通过导管冲洗预热的灌注溶液。停止泵并取出导管。然后将连接到导管的针尖以与静脉成10至20度角插入下腔静脉，从导管上取下针头。
然后以平行于静脉的运动轻轻地将导管推入静脉。将导管连接到导管，而无需将导管进一步移动到静脉中。以每分钟两毫升的流速启动泵。
寻找肝脏立即变白，作为灌注成功的标志。用剪刀剪开门静脉。逐渐将流速增加到每分钟五毫升。
一旦灌注溶液流过三个仔细监测肝脏的弹性。要确定肝脏是否软化，请用棉签或镊子轻轻按压肝脏，并检查肝脏上是否形成压痕。注意不要过度灌注，以免细胞活力丧失。
一旦肝脏在30至50毫升灌注溶液后软化，三次流过，停止泵，取出导管和胆囊。小心不要溢出其内容物。然后仔细解剖肝脏。
将肝脏放入含有冰冷DME M和10%FBS培养基的100毫米培养皿中。轻轻旋转培养皿以去除可能的血栓。将肝脏转移到含有冰冷DME M和10%FBS培养基的新培养皿中。
要从肝囊中释放细胞，请将培养皿放在冰上，然后使用两对无菌镊子，轻轻撕开所有叶上的肝囊。使用细胞提升器在培养基中轻轻旋转肝脏以释放肝细胞。继续这个动作，直到肝脏变得非常小，悬浮液变成棕色和不透明。
从平板上取出肝组织残留物，并使用设置为低速的25毫升血清移液器，小心地将细胞悬液转移到在冰上预冷并装有100微米细胞过滤器的50毫升锥形管中。将新鲜冰冷的DMEM和10%FBS培养基加入培养皿中，以洗掉并从表面收集剩余的细胞。然后，转移到50毫升锥形管中。
重复此步骤，直到收集所有细胞。要从非实质细胞中洗涤和纯化肝细胞，请将收集在50毫升锥形管中的细胞以50 RCF在4摄氏度下离心5分钟，低减速或没有任何中断。丢弃含有碎片和非实质细胞的超纳顿。
然后通过轻轻旋转管将沉淀重新悬浮在剩余的超级纳顿中。颗粒重悬后加入30毫升新鲜冰冷DMEM和10%FBS培养基。通过打开电穿孔设备上的电源按钮开始制备 CRISPR CAS 9 底物培养基、细胞和电穿孔仪。
然后通过按X按钮和向下箭头按钮设置电穿孔程序，直到程序T 0 28出现在屏幕上。通过将1.5毫升PM添加到六个孔胶原蛋白一包被板中，为电穿孔肝细胞制备目标孔。将板在 37 摄氏度的培养箱中孵育，直到准备使用。
在PCR分裂试管中，按照文本手稿中所述制备CAS 9 RMP和mRNA复合物。将mRNA SG RNA混合物储存在冰上直至电穿孔。另外，制备含有一微克E G F P MRNA的管，以使用荧光显微镜验证电穿孔成功。
在 100 RCF 下在 4 摄氏度下离心电穿孔反应两分钟。从细胞沉淀中取出上钠，并沿管壁侧面每次反应加入100微升核离子溶液。用手轻轻摇动试管，将肝细胞重新悬浮在电穿孔溶液中。
一旦肝细胞均匀分散在电穿孔溶液中，将100微升肝细胞悬浮液转移到含有CAS九个复合物的试管中。将条带孔的内容物转移到电穿孔容器中。将核兽医容器放入电穿孔装置上的槽中。
通过按X按钮电穿孔肝细胞。电穿孔后，等待设备上弹出一个屏幕，上面写着：好的。再次按下 X 按钮并卸下容器。
将电穿孔容器在冰上孵育15分钟。向电穿孔容器中加入500微升预武装PM中。将300微升电穿孔反应转移到预热板上的每个目的地孔中。
将板在 37 摄氏度下孵育过夜。将膜基质加入冰冷的肝细胞维持培养基中，并通过上下移液10次混合。接种细胞24小时后，从指定用于基因编辑分析的孔中取出培养基。
将覆盖混合物缓慢移液到细胞顶部，然后将板放回 37 摄氏度。在电镀后24小时，将条件培养基从指定用于MTT和白蛋白测定的孔中转移并储存在微离心管中，直到准备进行白蛋白测定。通过提取基因组DNA并按照文本手稿中所述设置PCR来继续分析靶标CAS九活性。
在接种后3至12小时内，肝细胞粘附在平板上，细胞形态在24小时内呈现出典型的多边形或六边形外观在接种后24小时内使用高碘酸移试剂通过糖原染色来验证分离细胞的纯度。染色肝细胞的细胞质呈洋红色。肝细胞在电穿孔后24小时成像，平均89.8%的肝细胞为GFP阳性。
在电穿孔后三天，CAS 9诱导HPD位点进行分析，结果显示用CRISPR Cas电穿孔的肝细胞中9个mRNA的靶插入缺失为47.4%，CAS 9个RNP的插入缺失为78.4%。MTT测定显示用CRISPR Cas九个mRNA和R n p处理的肝细胞的活力为35.4%和45.9%.与MTT结果一致，用CAS九RNA处理的肝细胞的标准化白蛋白水平为31.8%，CAS 9 r p的肝细胞的标准化白蛋白水平为34.5%。要记住的最重要的事情是，适当的插管会影响所有后续步骤和手术的成功。
完成此过程后，可以移植肝细胞和小鼠以研究其植入。此外，还可以提取接种肝细胞的基因组DNA，分析CAS nine编辑的效率和特异性。
