La principal ventaja de nuestra técnica es que es un enfoque fácil, rápido y reproducible para editar genes en hepatocitos primarios de ratón como una forma de generar modelos de enfermedades in vitro e in vivo. Usando nuestra técnica, puede ser posible derribar un gen objetivo en hepatocitos aislados y luego trasplantarlos nuevamente al paciente, para reemplazar las células enfermas con hepatocitos editados genéticamente. Los investigadores sin experiencia pueden tener dificultades con la canulación y mantener el catéter estable durante toda la perfusión. Se recomienda a los usuarios que lean y practiquen cuidadosamente el procedimiento y los métodos de solución de problemas antes de comenzar.
Demostrando la perfusión hepática y el aislamiento de hepatocitos estarán Tina Parker, gerente de instalaciones clínicas, e Ilayda Ates, asistente de investigación graduada. El procedimiento de electroporación será demostrado por Callie Stuart, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Bajo un plano quirúrgico de anestesia.
Comience la perfusión hepática haciendo una incisión lateral en forma de U en la piel del abdomen con tijeras y expanda el orificio a través de los lados. Continúe abriendo la piel a la caja torácica. Con unas tijeras, corte a través del peritoneo para exponer la cavidad abdominal hasta la caja torácica.
Tener cuidado de no cortar ningún órgano. Mueva los intestinos hacia el lado derecho usando la parte posterior de los fórceps o la superficie roma de las tijeras. Identificar la vena porta y la vena cava inferior.
Encienda la bomba para enjuagar la solución de perfusión precalentada a través del catéter. Detenga la bomba y retire el catéter. Luego inserte la punta de la aguja conectada al catéter en la vena cava inferior en un ángulo de 10 a 20 grados con respecto a la vena, retire la aguja del catéter.
Luego, empuje suavemente el catéter dentro de la vena en un movimiento paralelo a la vena. Conecte el tubo al catéter sin mover el catéter más adentro de la vena. Arranque la bomba con un caudal de dos mililitros por minuto.
Busque que el hígado se ponga pálido inmediatamente como una señal de que la perfusión es exitosa. Corte la vena porta con unas tijeras. Aumente gradualmente el caudal a cinco mililitros por minuto.
Una vez que la solución de perfusión tres está fluyendo a través de cuidadosamente controlar la elasticidad del hígado. Para determinar si el hígado se ha ablandado, presione suavemente el hígado con un hisopo de algodón o fórceps y verifique si se forman hendiduras en el hígado. Tenga cuidado de no sobrefundir para evitar la pérdida de viabilidad celular.
Una vez que el hígado se ablanda después de 30 a 50 mililitros de solución de perfusión, tres han fluido, detenga la bomba, retire el catéter y la vesícula biliar. Tenga cuidado de no derramar su contenido. Luego disecciona cuidadosamente el hígado.
Coloque el hígado en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga DME M helado con 10% de medio FBS. Agite la placa de Petri suavemente para eliminar posibles coágulos de sangre. Transfiera el hígado a una nueva placa de Petri que contenga DME M helado y 10% de FBS medio.
Para liberar células de la cápsula hepática, coloque la placa de Petri en hielo y luego use dos pares de pinzas estériles, separe suavemente la cápsula hepática en todos los lóbulos. Agite suavemente el hígado alrededor del medio usando un elevador celular para liberar los hepatocitos. Continúe este movimiento hasta que el hígado se vuelva muy pequeño y la suspensión se vuelva marrón y opaca.
Retire los restos de tejido hepático de la placa y, utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros ajustada a baja velocidad, transfiera cuidadosamente la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros preenfriado en hielo y equipado con un filtro celular de 100 micrómetros. Agregue DMEM fresco helado y 10% de medio FBS a la placa de Petri para lavar y recoger las células restantes de la superficie. Luego, transfiera al tubo cónico de 50 mililitros.
Repita este paso hasta que se recopilen todas las celdas. Para lavar y purificar los hepatocitos de las células no parenquimatosas, centrifugar las células recogidas en el tubo cónico de 50 mililitros a 50 RCF a cuatro grados centígrados durante cinco minutos a baja desaceleración o sin interrupciones. Deseche el super-natón que contiene desechos y células no parenquimatosas.
Luego vuelva a suspender el pellet en el super-naton sobrante girando suavemente el tubo. Después de la resuspensión de pellets, agregue 30 mililitros de DMEM fresco helado y 10% FBS medio. Comience a preparar los sustratos CRISPR CAS 9, los medios, las células y el instrumento de electroporación encendiendo el botón de encendido del dispositivo de electroporación.
A continuación, configure el programa de electroporación pulsando el botón X y, a continuación, el botón de flecha hacia abajo hasta que aparezca el programa T 0 28 en la pantalla. Se prepararon los pozos de destino para los hepatocitos electroporados agregando 1,5 mililitros de PM a seis placas de colágeno bien recubiertas. Incubar las placas en una incubadora de 37 grados centígrados hasta que estén listas para usar.
En tubos de tira dividida por PCR, prepare los complejos CAS 9 RMP y mRNA como se describe en el manuscrito de texto. Guarde la mezcla de ARN sg de ARN mN EN HIELO hasta la electroporación. Por separado, prepare un tubo que contenga un microgramo de ARNm de E G F P para verificar la electroporación exitosa utilizando microscopía de fluorescencia.
Centrifugar la reacción de electroporación a 100 RCF durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenado del pellet celular y agregue 100 microlitros de solución de nucleoffección por reacción a lo largo del lado de la pared del tubo. Vuelva a suspender los hepatocitos en la solución de electroporación balanceando el tubo suavemente con la mano.
Una vez que los hepatocitos estén dispersos uniformemente en la solución de electroporación, transfiera 100 microlitros de la suspensión de hepatocitos a los tubos de tira que contienen los nueve complejos CAS. Transfiera el contenido del pozo de la tira a un recipiente de electroporación. Coloque el vaso nucleo-veterinario en la ranura del dispositivo de electroporación.
Electroporar los hepatocitos pulsando el botón X. Después de la electroporación, espere a que aparezca una pantalla en el dispositivo que diga: Está bien. Presione el botón X nuevamente y retire el recipiente.
Incubar el recipiente electroporado en hielo durante 15 minutos. Agregue 500 microlitros de PM armado previamente al recipiente de electroporación. Transfiera 300 microlitros de la reacción de electroporación a cada pozo de destino en la placa precalentada.
Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue la matriz de membrana al medio de mantenimiento de hepatocitos helado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Retire el medio de los pocillos designados para el análisis de edición de genes 24 horas después de colocar las células.
Pipetea la mezcla de recubrimiento lentamente sobre las celdas y vuelve a colocar la placa a 37 grados centígrados. A las 24 horas después del recubrimiento, transfiera el medio acondicionado del pocillo designado para los ensayos de MTT y albúmina y guárdelo en un tubo de microfuga hasta que esté listo para realizar el ensayo de albúmina. Proceda con el análisis de la actividad CAS nueve objetivo extrayendo el ADN genómico y configurando la PCR como se describe en el manuscrito de texto.
Dentro de las 3 a 12 horas posteriores al recubrimiento, los hepatocitos se adhirieron a la placa y la morfología celular asumió una apariencia poligonal o hexagonal típica dentro de las 24 horas. La pureza de las células aisladas se verificó mediante tinción de glucógeno utilizando el reactivo de cambio ácido periódico a las 24 horas después del recubrimiento. El citoplasma de los hepatocitos teñidos parecía magenta. Los hepatocitos fueron fotografiados 24 horas después de la electroporación y, en promedio, el 89,8% de los hepatocitos fueron GFP positivos.
A los tres días después de la electroporación se analizaron nueve inducidos en el locus HPD y los resultados mostraron en el objetivo indeles de 47,4% en hepatocitos electroporados con CRISPR Cas nueve ARNm y 78,4% indels para el CAS nueve RNP. El ensayo MTT mostró una viabilidad del 35,4 y 45,9% en hepatocitos tratados con CRISPR Cas nueve ARNm y R N P.De acuerdo con los resultados de MTT, los niveles normalizados de albúmina fueron del 31,8% en los hepatocitos tratados con ARN de nueve CAS y del 34,5% para CAS nueve rp. Lo más importante a recordar es que la canulación adecuada afecta todos los pasos posteriores y el éxito del procedimiento.
Después de este procedimiento, los hepatocitos pueden ser trasplantados y ratones para investigar sus injertos. Además, el ADN genómico de los hepatocitos plateados se puede extraer para analizar la eficiencia y la especificidad de la edición de CAS nueve.
