Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass es sich um einen einfachen, schnellen und reproduzierbaren Ansatz zur Bearbeitung von Genen in primären Maushepatozyten handelt, um in vitro und in vivo Krankheitsmodelle zu generieren. Mit unserer Technik könnte es möglich sein, ein Zielgen in isolierten Hepatozyten niederzuschlagen und sie dann wieder in den Patienten zu transplantieren, um kranke Zellen durch geneditierte Hepatozyten zu ersetzen Unerfahrene Forscher könnten mit der Kanülierung und der Aufrechterhaltung des Katheters während der gesamten Perfusion zu kämpfen haben. Den Benutzern wird empfohlen, das Verfahren und die Methoden zur Fehlerbehebung sorgfältig zu lesen und zu üben, bevor sie beginnen.
Die Leberperfusion und Hepatozytenisolierung demonstrieren Tina Parker, eine klinische Facility Managerin, und Ilayda Ates, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin. Das Elektroporationsverfahren wird von Callie Stuart, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Unter einer chirurgischen Anästhesieebene.
Beginnen Sie die Leberperfusion, indem Sie mit einer Schere einen U-förmigen seitlichen Schnitt in die Bauchhaut machen und das Loch durch die Seiten erweitern. Öffnen Sie die Haut weiter zum Brustkorb. Schneiden Sie mit einer Schere durch das Peritoneum, um die Bauchhöhle bis zum Brustkorb freizulegen.
Achten Sie darauf, keine Organe zu schneiden. Bewegen Sie den Darm mit der Rückseite der Pinzette oder der stumpfen Oberfläche der Schere auf die rechte Seite. Identifizieren Sie die Pfortader und die Vena cava inferior.
Starten Sie die Pumpe, um die vorgewärmte Perfusionslösung durch den Katheter zu spülen. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den Katheter. Führen Sie dann die Spitze der Nadel, die mit dem Katheter verbunden ist, in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zur Vene in die untere Hohlvene ein und entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter.
Drücken Sie dann den Katheter vorsichtig in einer Bewegung parallel zur Vene in die Vene. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter, ohne den Katheter weiter in die Vene zu bewegen. Starten Sie die Pumpe mit einer Fördermenge von zwei Milliliter pro Minute.
Suchen Sie nach der Leber, die sofort blass wird, als Zeichen dafür, dass die Durchblutung erfolgreich ist. Schneiden Sie die Portalvene mit einer Schere ab. Erhöhen Sie die Durchflussrate schrittweise auf fünf Milliliter pro Minute.
Sobald die Perfusionslösung drei durchfließt, überwachen Sie sorgfältig die Elastizität der Leber. Um festzustellen, ob die Leber weich geworden ist, drücken Sie die Leber vorsichtig mit einem Wattestäbchen oder einer Pinzette und prüfen Sie, ob sich Vertiefungen auf der Leber bilden. Achten Sie darauf, nicht zu perfundiert, um einen Verlust der Zelllebensfähigkeit zu vermeiden.
Sobald die Leber erweicht ist, nachdem 30 bis 50 Milliliter Perfusionslösung drei durchgeflossen sind, stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und die Gallenblase. Achten Sie darauf, den Inhalt nicht zu verschütten. Dann sezieren Sie vorsichtig die Leber.
Geben Sie die Leber in eine 100 Millimeter Petrischale mit eiskaltem DME M mit 10% FBS-Medium. Schwenken Sie die Petrischale vorsichtig, um mögliche Blutgerinnsel zu entfernen. Übertragen Sie die Leber in eine neue Petrischale, die eiskaltes DME M und 10% FBS-Medium enthält.
Um Zellen aus der Leberkapsel freizusetzen, legen Sie die Petrischale auf Eis und reißen Sie die Leberkapsel vorsichtig mit zwei sterilen Pinzettenpaaren an allen Lappen auseinander. Wirbeln Sie die Leber vorsichtig im Medium mit einem Zelllifter herum, um die Hepatozyten freizusetzen. Setzen Sie diese Bewegung fort, bis die Leber sehr klein wird und die Suspension braun und undurchsichtig wird.
Entfernen Sie die Lebergewebereste von der Platte und geben Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer auf niedrige Geschwindigkeit eingestellten 25-Milliliter-serologischen Pipette in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen über, das auf Eis vorgekühlt und mit einem 100-Mikrometer-Zellsieb ausgestattet ist. Fügen Sie frisches eiskaltes DMEM und 10% FBS-Medium in die Petrischale hinzu, um die verbleibenden Zellen von der Oberfläche auszuwaschen und zu sammeln. Dann in das 50 Milliliter konische Rohr überführen.
Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Zellen gesammelt sind. Um Hepatozyten aus nicht-parenchymalen Zellen zu waschen und zu reinigen, zentrifugieren Sie die im 50-Milliliter-Konikusröhrchen gesammelten Zellen bei 50 RCF bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang bei geringer Verzögerung oder ohne Unterbrechungen. Entsorgen Sie das Super-Naton, das Trümmer und nicht-parenchymale Zellen enthält.
Suspendieren Sie dann das Pellet im übrig gebliebenen Super-Naton, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Nach der Pellet-Resuspension 30 Milliliter frisches eiskaltes DMEM und 10% FBS-Medium hinzufügen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der CRISPR CAS 9-Substrate, Medien, Zellen und des Elektroporationsinstruments, indem Sie den Netzschalter am Elektroporationsgerät einschalten.
Stellen Sie dann das Elektroporationsprogramm ein, indem Sie die X-Taste und dann die Pfeiltaste nach unten drücken, bis das Programm T 0 28 auf dem Bildschirm erscheint. Vorbereitung der Zielvertiefungen für die elektropolierten Hepatozyten durch Zugabe von 1,5 Milliliter PM zu sechs gut kollagenbeschichteten Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem 37-Grad-Inkubator, bis sie einsatzbereit sind.
In PCR-Spaltstreifenröhrchen die CAS 9 RMP- und mRNA-Komplexe wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt. Lagern Sie die mRNA SG RNA-Mischung bis zur Elektroporation auf Eis. Bereiten Sie separat ein Röhrchen mit einem Mikrogramm E G F P mRNA vor, um eine erfolgreiche Elektroporation mittels Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen.
Zentrifugieren Sie die Elektroporationsreaktion bei 100 RCF für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Supernaton aus dem Zellpellet und fügen Sie 100 Mikroliter Nukleoffektionslösung pro Reaktion entlang der Seite der Röhrchenwand hinzu. Suspendieren Sie die Hepatozyten in der Elektroporationslösung, indem Sie das Rohr vorsichtig von Hand schaukeln.
Sobald die Hepatozyten gleichmäßig in der Elektroporationslösung verteilt sind, werden 100 Mikroliter der Hepatozytensuspension in die Streifenröhrchen überführt, die die CAS-Neun-Komplexe enthalten. Den Inhalt der Streifenmulde in ein Elektroporationsgefäß überführen. Setzen Sie das Nukleo-Vet-Gefäß in den Schlitz des Elektroporationsgeräts ein.
Elektropolieren Sie die Hepatozyten durch Drücken der X-Taste. Warten Sie nach der Elektroporation, bis auf dem Gerät ein Bildschirm mit der Aufschrift Okay angezeigt wird. Drücken Sie erneut die X-Taste und entfernen Sie das Gefäß.
Inkubieren Sie das elektropolierte Gefäß 15 Minuten auf Eis. Fügen Sie dem Elektroporationsgefäß 500 Mikroliter eines vorbewaffneten PM hinzu. 300 Mikroliter der Elektroporationsreaktion auf der vorgewärmten Platte in jede Zielmulde überführen.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie die Membranmatrix zu eiskaltem Hepatozyten-Erhaltungsmedium hinzu und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Entfernen Sie das Medium 24 Stunden nach der Beschichtung der Zellen aus den Vertiefungen, die für die Gen-Editing-Analyse vorgesehen sind.
Pipetten Sie die Overlay-Mischung langsam auf die Zellen und stellen Sie die Platte wieder auf 37 Grad Celsius. 24 Stunden nach der Beschichtung wird das konditionierte Medium aus der für MTT- und Albumintests vorgesehenen Bohrung überführt und in einem Mikrofugenröhrchen gelagert, bis der Albumintest durchgeführt werden kann. Fahren Sie mit der Analyse der CAS nine-Zielaktivität fort, indem Sie die genomische DNA extrahieren und die PCR wie im Textmanuskript beschrieben einrichten.
Innerhalb von 3 bis 12 Stunden nach der Beschichtung hafteten die Hepatozyten an der Platte und die Zellmorphologie nahm innerhalb von 24 Stunden ein typisches polygonales oder hexagonales Aussehen an. Die Reinheit der isolierten Zellen wurde durch Glykogenfärbung mit dem periodischen Säureverschiebungsreagenz 24 Stunden nach der Beschichtung überprüft. Das Zytoplasma der gefärbten Hepatozyten erschien magenta. Die Hepatozyten wurden 24 Stunden nach der Elektroporation abgebildet und im Durchschnitt waren 89,8% der Hepatozyten GFP-positiv.
Drei Tage nach der Elektroporation wurde CAS nine im HPD-Locus induziert und die Ergebnisse zeigten auf Zielindels von 47,4% in Hepatozyten, die mit CRISPR Cas elektropoliert wurden, neun mRNA und 78,4% Indels für die CAS neun RNP. Der MTT-Assay zeigte 35,4 und 45,9% Lebensfähigkeit in Hepatozyten, die mit CRISPR Cas nine mRNA und RN P behandelt wurden.In Übereinstimmung mit den MTT-Ergebnissen betrugen die normalisierten Albuminspiegel 31,8% in Hepatozyten, die mit CAS nine RNA behandelt wurden, und 34,5% in CAS nine r p. Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, dass die richtige Kanülierung alle späteren Schritte und den Erfolg des Verfahrens beeinflusst.
Nach diesem Verfahren können die Hepatozyten transplantiert werden und Mäuse, um ihre Transplantate zu untersuchen. Darüber hinaus kann die genomische DNA von plattierten Hepatozyten extrahiert werden, um die Effizienz und Spezifität der CAS nine-Bearbeitung zu analysieren.
