私たちの技術の主な利点は、in vitroおよびin vivo疾患モデルを生成する方法として、初代マウス肝細胞の遺伝子を編集するための簡単、迅速、かつ再現性のあるアプローチであることです。私たちの技術を使用すると、単離された肝細胞で標的遺伝子をノックダウンしてから患者に移植し、罹患細胞を遺伝子編集肝細胞に置き換えることができるかもしれません。 経験の浅い研究者は、カニューレ挿入と灌流中のカテーテルの安定性の維持に苦労する可能性があります。ユーザーは、開始する前に、手順とトラブルシューティング方法を注意深く読み、練習することをお勧めします。
肝灌流と肝細胞分離を実証するのは、臨床施設マネージャーのティナパーカーと大学院研究助手のイライダエイツです。エレクトロポレーション手順は、私の研究室の大学院研究助手であるカリー・スチュアートによって実証されます。麻酔の手術面の下。
ハサミを使用して腹部の皮膚をU字型の横方向切開を行うことによって肝臓灌流を開始し、側面から穴を広げます。胸郭に皮膚を開き続けます。ハサミを使用して腹膜を切り裂き、腹腔を胸郭まで露出させます。
臓器を傷つけないように注意してください。鉗子の後ろまたははさみの鈍い面を使って腸を右側に動かします。門脈と下大静脈を特定します。
ポンプを始動して、予熱した灌流溶液をカテーテルから洗い流します。ポンプを停止し、カテーテルを取り外します。次に、カテーテルに接続された針の先端を静脈に対して10〜20度の角度で下大静脈に挿入し、カテーテルから針を取り外します。
次に、静脈と平行な動きでカテーテルを静脈にそっと押し込みます。カテーテルをさらに静脈内に動かさずに、チューブをカテーテルに接続します。毎分2ミリリットルの流量でポンプを始動します。
灌流が成功した兆候として、肝臓がすぐに青白くなるのを探します。ハサミを使って門脈を切ります。流量を毎分5ミリリットルまで徐々に増やします。
灌流液3が流れたら肝臓の弾力性を注意深く監視する。肝臓が柔らかくなったかどうかを判断するには、綿棒または鉗子で肝臓をそっと押し、肝臓にくぼみができるかどうかを確認します。細胞の生存率の損失を避けるために、灌流しすぎないように注意してください。.
30〜50ミリリットルの灌流液3が流れた後に肝臓が柔らかくなったら、ポンプを停止し、カテーテルと胆嚢を取り外します。中身をこぼさないように注意してください。それから慎重に肝臓を解剖します。
肝臓を、10%FBS培地を含む氷冷DMEMMを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。ペトリ皿をそっと回転させて、血栓を取り除きます。肝臓を氷冷DME Mと10%FBS培地を含む新しいペトリ皿に移します。
肝嚢から細胞を放出するには、ペトリ皿を氷の上に置き、2対の滅菌鉗子を使用して、すべての葉の肝被膜をそっと引き裂きます。セルリフターを使用して培地内で肝臓を静かに回転させ、肝細胞を放出します。肝臓が非常に小さくなり、懸濁液が茶色で不透明になるまで、この動きを続けます。
肝臓組織残りをプレートから取り出し、低速に設定された25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を氷上で予め冷却し、100マイクロメートルの細胞ストレーナーを取り付けた50ミリリットルの円錐形チューブに注意深く移します。新鮮な氷冷DMEMと10%FBS培地をペトリ皿に加え、表面から残りの細胞を洗い流して回収します。次に、50ミリリットルの円錐管に移します。
すべてのセルが収集されるまで、この手順を繰り返します。非実質細胞から肝細胞を洗浄して精製するには、50ミリリットルの円錐管に集められた細胞を摂氏4度で50 RCFで、低減速または休憩なしで5分間遠心分離します。破片や非実質細胞を含むスーパーナトンを廃棄します。
次に、チューブを静かに回転させて、ペレットを残りのスーパーナトンに再懸濁します。ペレット再懸濁後、30ミリリットルの新鮮な氷冷DMEMおよび10%FBS培地を加える。エレクトロポレーション装置の電源ボタンをオンにして、CRISPR CAS 9基質培地、細胞、エレクトロポレーション装置の準備を開始します。
次に、プログラムT 0 28が画面に表示されるまでXボタンを押してから下矢印ボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを設定します。1.5ミリリットルのPMをコラーゲン1枚コーティングプレート6ウェルに添加することにより、エレクトロポレーション肝細胞用のデスティネーションウェルを調製した。使用する準備ができるまで、摂氏37度のインキュベーターでプレートをインキュベートします。
PCRスプリットストリップチューブでは、テキスト原稿に記載されているようにCAS 9 RMPおよびmRNA複合体を調製します。mRNA SG RNAミックスをエレクトロポレーションまで氷上に保存します。別途、1マイクログラムのE G F P mRNAを含むチューブを作製し、蛍光顕微鏡を用いてエレクトロポレーションの成功を検証した。
エレクトロポレーション反応を100 RCFで摂氏4度で2分間遠心分離します。細胞ペレットからスーパーナトンを取り除き、チューブ壁の側面に沿って反応ごとに100マイクロリットルの核攻撃溶液を追加します。チューブを手で穏やかに揺らして、肝細胞をエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。
肝細胞がエレクトロポレーション溶液中に均一に分散したら、100マイクロリットルの肝細胞懸濁液をCAS9複合体を含むストリップチューブに移す。ストリップの内容物をエレクトロポレーション容器によく移す。ヌクレオベット容器をエレクトロポレーション装置のスロットに入れます。
Xボタンを押して肝細胞をエレクトロポレーションします。エレクトロポレーション後、デバイスに次のような画面がポップアップするのを待ちます:わかりました。もう一度Xボタンを押して、容器を取り外します。
エレクトロポレーション容器を氷上で15分間インキュベートします。500マイクロリットルのプレアームPMをエレクトロポレーション容器に加える。300マイクロリットルのエレクトロポレーション反応を、予め温めたプレート上の各目的地ウェルに移す。
プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。メンブレンマトリックスを氷冷肝細胞維持培地に加え、上下に10回ピペッティングして混合します。細胞をプレーティングしてから24時間後に、遺伝子編集解析用に指定されたウェルから培地を取り出します。
オーバーレイ混合物をセルの上にゆっくりとピペットで置き、プレートを摂氏37度に戻します。プレーティング後24時間で、MTTおよびアルブミンアッセイ用に指定されたウェルからコンディショニング培地を移し、アルブミンアッセイを実行する準備ができるまでマイクロフュージチューブに保管します。ゲノムDNAを抽出し、本文に記載されているようにPCRを設定することにより、ターゲット上のCASナイン活性の解析を進めます。
プレーティングから3〜12時間以内に、プレートに接着した肝細胞と細胞形態が典型的な多角形または六角形の外観を想定し、24時間以内に単離された細胞の純度を、プレーティング後24時間で周期的酸シフト試薬を使用したグリコーゲン染色によって検証しました。染色された肝細胞の細胞質はマゼンタ色に見えた。肝細胞はエレクトロポレーションの24時間後に画像化され、平均して肝細胞の89.8%がGFP陽性であった。
エレクトロポレーションの3日後に、分析したところHPD遺伝子座でCASナインが誘導され、結果は、CRISPR Cas9 mRNAでエレクトロポレーションされた肝細胞で47.4%、CASナインRNPで78.4%のインデルを標的に示しました。MTTアッセイは、CRISPR Cas9 mRNAおよびRNPで処理された肝細胞において35.4%および45.9%の生存率を示した.MTT結果と一致して、正規化されたアルブミンレベルは、CASナインRNAで処理された肝細胞で31.8%、CASナインr pで34.5%であった。覚えておくべき最も重要なことは、適切なカニューレ挿入が後のすべてのステップと手順の成功に影響を与えるということです。
この手順の後、肝細胞を移植し、マウスにそれらの生着を調べることができる。さらに、播種肝細胞のゲノムDNAを抽出して、CASナイン編集の効率と特異性を解析することができます。
