היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שמדובר בגישה קלה, מהירה וניתנת לשחזור לעריכת גנים בהפטוציטים ראשוניים של עכברים כדרך ליצור מודלים של מחלות in vitro ו- in vivo. באמצעות הטכניקה שלנו, ייתכן שניתן יהיה להפיל גן מטרה בהפטוציטים מבודדים ולאחר מכן להשתיל אותם בחזרה לחולה, כדי להחליף תאים חולים בהפטוציטים ערוכים גנטית חוקרים לא מנוסים עשויים להיאבק עם קנולציה ושמירה על קטטר יציב לאורך כל הזליפה. מומלץ למשתמשים לקרוא בעיון ולתרגל את ההליך ואת שיטות פתרון הבעיות לפני תחילת העבודה.
בהדגמת זליגת הכבד ובידוד הפטוציטים יהיו טינה פרקר מנהלת מתקן קליני ואיליידה אטס, עוזרת מחקר לתואר שני. הליך האלקטרופורציה יודגם על ידי קאלי סטיוארט, עוזרת מחקר לתואר שני מהמעבדה שלי. תחת מטוס כירורגי של הרדמה.
מתחילים את זליגת הכבד על ידי ביצוע חתך רוחבי בצורת U בעור הבטן באמצעות מספריים, ומרחיבים את החור דרך הצדדים. ממשיכים לפתוח את העור לכלוב הצלעות. באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן עד צלעות.
נזהר לא לנקב איברים. הזז את המעיים לצד ימין באמצעות גב מלקחיים או משטח קהה של מספריים. זהה את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון.
הפעל את המשאבה כדי לשטוף תמיסת זלוף שחוממה מראש דרך הצנתר. יש לעצור את המשאבה ולהוציא את הקטטר. לאחר מכן להחדיר את קצה המחט המחוברת לקטטר לתוך הווריד הנבוב התחתון בזווית של 10 עד 20 מעלות לווריד, להסיר את המחט מהקטטר.
לאחר מכן דחף בעדינות את הקטטר לתוך הווריד בתנועה מקבילה לווריד. חבר את הצינורות לקטטר מבלי להזיז את הקטטר עוד יותר לתוך הווריד. הפעל את המשאבה עם קצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.
חפש את הכבד מיד הופך חיוור כסימן כי הזלוף מוצלח. גזור את וריד הפורטל באמצעות מספריים. הגדל בהדרגה את קצב הזרימה לחמישה מיליליטר לדקה.
לאחר תמיסת הזלוף שלוש זורם דרך בזהירות לפקח על גמישות הכבד. כדי לקבוע אם הכבד התרכך, לחץ בעדינות על הכבד עם צמר גפן או מלקחיים ובדוק אם נוצרות כניסות על הכבד. היזהרו שלא לחדור יתר על המידה כדי למנוע אובדן כדאיות התא.
ברגע שהכבד מתרכך לאחר 30 עד 50 מיליליטר של תמיסת זלוף שלוש זרמו דרך, עצרו את המשאבה, הסירו את הקטטר ואת כיס המרה. נזהר לא לשפוך את תוכנו. ואז בזהירות לנתח את הכבד.
הכניסו את הכבד לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DME M קר כקרח עם 10% FBS בינוני. סובבו את צלחת הפטרי בעדינות כדי להסיר קרישי דם אפשריים. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי חדשה המכילה DME M קר כקרח ומדיום 10% FBS.
כדי לשחרר תאים מכמוסת הכבד, הניחו את צלחת הפטרי על קרח ואז באמצעות שני זוגות מלקחיים סטריליים, קרעו בעדינות את קפסולת הכבד על כל האונות. סובבו בעדינות את הכבד במדיום באמצעות מרים תאים כדי לשחרר את ההפטוציטים. המשך בתנועה זו עד שהכבד הופך קטן מאוד וההשעיה הופכת חומה ואטומה.
הסר את שאריות רקמת הכבד מהצלחת ובאמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר שנקבעה למהירות נמוכה, העבר בזהירות את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר מקורר מראש על קרח ומצויד במסננת תאים של 100 מיקרומטר. הוסיפו DMEM קר כקרח, ו-10% FBS בינוני לצלחת פטרי כדי לשטוף ולאסוף את התאים הנותרים מפני השטח. לאחר מכן, העבר לצינור החרוטי של 50 מיליליטר.
חזור על שלב זה עד שכל התאים נאספים. כדי לשטוף ולטהר את ההפטוציטים מתאים שאינם פרנכימליים, צנטריפוגה של התאים שנאספו בצינור החרוטי של 50 מיליליטר ב-50 RCF בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בהאטה נמוכה או ללא הפסקות. השליכו את הסופר-נאטון המכיל פסולת ותאים שאינם פרנכימליים.
לאחר מכן השהה מחדש את הכדור בשאריות הסופר-נטון על ידי סיבוב עדין של הצינור. לאחר ההשעיה מחדש של גלולה להוסיף 30 מיליליטר של DMEM קר כקרח טרי ו 10% FBS בינוני. התחל להכין את מדיית המצעים, התאים ומכשיר האלקטרופורציה של CRISPR CAS 9 על-ידי הפעלת לחצן ההפעלה בהתקן האלקטרופורציה.
לאחר מכן הגדר את תוכנית האלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן X ולאחר מכן על לחצן החץ למטה עד שהתוכנית T 0 28 מופיעה על המסך. הכין את בארות היעד עבור hepatocytes אלקטרופוציה על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של PM לשש צלחות מצופות קולגן היטב. דגירה של הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש.
בצינורות רצועה מפוצלים של PCR, הכינו את קומפלקסי CAS 9 RMP ו-mRNA כמתואר בכתב היד של הטקסט. יש לאחסן את תערובת ה-mRNA SG RNA על קרח עד לאלקטרופורציה. בנפרד, הכינו צינור המכיל מיקרוגרם אחד של E G F P mRNA כדי לאמת אלקטרופורציה מוצלחת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
צנטריפוגה של תגובת האלקטרופורציה ב-100 RCF למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנאטון מכדור התא והוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוקלאופקציה לכל תגובה לאורך דופן הצינור. להשעות מחדש את ההפטוציטים בתמיסת האלקטרופורציה על ידי נדנדת הצינור בעדינות ביד.
לאחר שהפטוציטים מתפזרים באופן שווה בתמיסת האלקטרופורציה, העבירו 100 מיקרוליטרים של ההשעיה של ההפטוציטים לצינורות הרצועה המכילים את תשעת הקומפלקסים של CAS. מעבירים את תוכן הרצועה היטב לכלי אלקטרופורציה. הנח את כלי הנוקליאו-וטרינר לתוך החריץ במכשיר האלקטרופורציה.
אלקטרופוט ההפטוציטים על ידי לחיצה על כפתור X. לאחר האלקטרופורציה, המתן עד שיופיע מסך במכשיר שאומר:אוקיי. לחץ שוב על כפתור X והסר את הספינה.
לדגור את הכלי החשמלי על הקרח במשך 15 דקות. הוסף 500 מיקרוליטרים של PM חמוש מראש לכלי האלקטרופורציה. מעבירים 300 מיקרוליטרים של תגובת האלקטרופורציה לכל יעד היטב על הצלחת שחוממה מראש.
לדגור את הצלחות במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו את מטריצת הממברנה למדיום תחזוקת הפטוציטים הקרים כקרח וערבבו על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. הסר את המדיום מהבארות המיועדות לניתוח עריכת גנים 24 שעות לאחר ציפוי התאים.
מזלפים את תערובת הכיסוי באיטיות על גבי התאים ומחזירים את הצלחת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ב-24 שעות לאחר הציפוי, מעבירים את המדיום המותנה מהבאר המיועדת למבחני MTT ואלבומין ומאחסנים בצינור מיקרו-פוגה עד שהם מוכנים לביצוע בדיקת האלבומין. המשך בניתוח של פעילות CAS תשע על ידי חילוץ הדנ"א הגנומי והגדרת ה- PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט.
תוך 3 עד 12 שעות מהציפוי ההפטוציטים נדבקו לצלחת ומורפולוגיה של התא הניחה מראה מצולע או משושה טיפוסי תוך 24 שעות טוהר התאים המבודדים אומת באמצעות צביעת גליקוגן באמצעות מגיב משמרת חומצה תקופתית 24 שעות לאחר הציפוי. הציטופלסמה של ההפטוציטים המוכתמים הופיעה מג'נטה. ההפטוציטים צולמו 24 שעות לאחר האלקטרופורציה ובממוצע, 89.8% מההפטוציטים היו חיוביים ל-GFP.
בשלושה ימים לאחר האלקטרופורציה CAS תשעה המושרים בלוקוס HPD שם נותחו והתוצאות הראו על אינדלים מטרה של 47.4% בהפטוציטים שעברו אלקטרופוטציה עם CRISPR Cas תשעה mRNA ו-78.4% אינדלים עבור CAS תשעה RNP. בדיקת MTT הראתה כדאיות של 35.4 ו-45.9% בהפטוציטים שטופלו ב-CRISPR Cas תשעה mRNA ו-R N P.בהתאם לתוצאות ה-MTT, רמות האלבומין המנורמל היו 31.8% בהפטוציטים שטופלו ב-CAS 9 RNA ו-34.5% ב-CAS nine r p. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי cannulation תקין משפיע על כל השלבים המאוחרים יותר ואת ההצלחה של ההליך.
לאחר הליך זה, ניתן להשתיל את ההפטוציטים ועכברים לחקור את החריטות שלהם. יתר על כן, ניתן לחלץ את הדנ"א הגנומי של הפטוציטים המצופים כדי לנתח את היעילות והספציפיות של עריכת CAS 9.
