Tekniğimizin temel avantajı, in vitro ve in vivo hastalık modelleri üretmenin bir yolu olarak primer fare hepatositlerindeki genleri düzenlemek için kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olmasıdır. Tekniğimizi kullanarak, izole hepatositlerde bir hedef geni yıkmak ve daha sonra bunları hastaya geri nakletmek, hastalıklı hücreleri gen düzenlenmiş hepatositlerle değiştirmek mümkün olabilir Deneyimsiz araştırmacılar kanülasyonla mücadele edebilir ve kateteri perfüzyon boyunca sabit tutabilir. Kullanıcıların başlamadan önce prosedürü ve sorun giderme yöntemlerini dikkatlice okumaları ve uygulamaları önerilir.
Karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonunu gösteren, klinik tesis müdürü Tina Parker ve lisansüstü araştırma görevlisi Ilayda Ates olacaktır. Elektroporasyon prosedürü, laboratuvarımdan mezun bir araştırma asistanı olan Callie Stuart tarafından gösterilecek. Cerrahi anestezi düzlemi altında.
Makas kullanarak karın derisinde U şeklinde bir lateral kesi yaparak karaciğer perfüzyonuna başlayın ve deliği yanlardan genişletin. Cildi göğüs kafesine açmaya devam edin. Makas kullanarak, karın boşluğunu göğüs kafesine kadar açığa çıkarmak için periton boyunca kesin.
Herhangi bir organı nicklememeye dikkat etmek. Forsepsin arkasını veya makasın künt yüzeyini kullanarak bağırsakları sağ tarafa hareket ettirin. Portal veni ve inferior vena kavayı tanımlayın.
Önceden ısıtılmış perfüzyon solüsyonunu kateterden temizlemek için pompayı çalıştırın. Pompayı durdurun ve kateteri çıkarın. Daha sonra katetere bağlı iğnenin ucunu damara 10 ila 20 derecelik bir açıyla inferior vena kavaya yerleştirin, iğneyi kateterden çıkarın.
Daha sonra kateteri damara paralel bir hareketle yavaşça damarın içine itin. Kateteri damarın içine daha fazla hareket ettirmeden tüpü kateterle bağlayın. Pompayı dakikada iki mililitre debi ile çalıştırın.
Perfüzyonun başarılı olduğunun bir işareti olarak karaciğerin hemen soluklaşmasını bekleyin. Portal damarı makas kullanarak kesin. Akış hızını kademeli olarak dakikada beş mililitreye yükseltin.
Perfüzyon çözeltisi üçü aktıktan sonra karaciğerin elastikiyetini dikkatlice izleyin. Karaciğerin yumuşayıp yumuşamadığını belirlemek için, karaciğeri pamuklu çubukla veya forseps ile hafifçe bastırın ve karaciğerde girintilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin. Hücre canlılığının kaybını önlemek için aşırı perfüzyona dikkat edin.
Karaciğer 30 ila 50 mililitre perfüzyon çözeltisinden sonra yumuşadıktan sonra, üç tanesi aktığında, pompayı durdurun, kateteri ve safra kesesini çıkarın. İçeriğini dökmemeye dikkat edin. Sonra karaciğeri dikkatlice inceleyin.
Karaciğeri% 10 FBS ortamı ile buz gibi soğuk DME M içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Olası kan pıhtılarını gidermek için Petri kabını yavaşça döndürün. Karaciğeri buz gibi soğuk DME M ve% 10 FBS ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.
Karaciğer kapsülünden hücreleri serbest bırakmak için, Petri kabını buzun üzerine yerleştirin, ardından iki çift steril forseps kullanarak, karaciğer kapsülünü tüm loblarda yavaşça parçalayın. Hepatositleri serbest bırakmak için bir hücre kaldırıcı kullanarak karaciğeri yavaşça ortamın etrafında döndürün. Karaciğer çok küçülene ve süspansiyon kahverengi ve opak hale gelene kadar bu harekete devam edin.
Karaciğer dokusu kalıntılarını plakadan çıkarın ve düşük hıza ayarlanmış 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu buz üzerinde önceden soğutulmuş ve 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile donatılmış 50 mililitrelik bir konik tüpe dikkatlice aktarın. Kalan hücreleri yüzeyden yıkamak ve toplamak için Petri kabına taze buz gibi soğuk DMEM ve% 10 FBS ortamı ekleyin. Ardından, 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Tüm hücreler toplanana kadar bu adımı yineleyin. Hepatositleri parankimal olmayan hücrelerden yıkamak ve saflaştırmak için, 50 mililitrelik konik tüpte toplanan hücreleri, düşük yavaşlamada veya herhangi bir mola vermeden beş dakika boyunca dört santigrat derecede 50 RCF'de santrifüj edin. Enkaz ve parankimal olmayan hücreler içeren süper-natonu atın.
Ardından, tüpü yavaşça döndürerek peleti artık süper natonda yeniden askıya alın. Pelet yeniden süspansiyonundan sonra 30 mililitre taze buz gibi soğuk DMEM ve% 10 FBS ortamı ekleyin. Elektroporasyon cihazındaki güç düğmesini açarak CRISPR CAS 9 substrat ortamını, hücrelerini ve elektroporasyon cihazını hazırlamaya başlayın.
Ardından, ekranda T 0 28 programı görünene kadar X düğmesine ve ardından aşağı ok düğmesine basarak elektroporasyon programını ayarlayın. Elektroporatörlü hepatositler için hedef kuyuları, altı kuyu kollajen tek kaplamalı plakaya 1,5 mililitre PM eklenerek hazırlandı. Plakaları kullanıma hazır olana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
PCR bölünmüş şerit tüplerinde, CAS 9 RMP ve mRNA komplekslerini metin yazısında açıklandığı şekilde hazırlayın. mRNA SG RNA karışımını elektroporasyona kadar buz üzerinde saklayın. Ayrı olarak, floresan mikroskobu kullanarak başarılı elektroporasyonu doğrulamak için bir mikrogram E G F P mRNA içeren bir tüp hazırlayın.
Elektroporasyon reaksiyonunu 100 RCF'de dört santigrat derecede iki dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatonu hücre peletinden çıkarın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca reaksiyon başına 100 mikrolitre nükleofeksiyon çözeltisi ekleyin. Elektroporasyon çözeltisindeki hepatositleri, tüpü elle hafifçe sallayarak yeniden askıya alın.
Hepatositler elektroporasyon çözeltisinde eşit olarak dağıldıktan sonra, hepatosit süspansiyonunun 100 mikrolitresini CAS dokuz kompleksini içeren şerit tüplere aktarın. Şeridin içeriğini bir elektroporasyon kabına iyice aktarın. Nükleo-veteriner damarını elektroporasyon cihazındaki yuvaya yerleştirin.
X düğmesine basarak hepatositleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan sonra, cihazda şöyle bir ekran açılmasını bekleyin:Tamam. X düğmesine tekrar basın ve kabı çıkarın.
Elektroporated kabı 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Elektroporasyon kabına 500 mikrolitre önceden silahlanmış bir PM ekleyin. Elektroporasyon reaksiyonunun 300 mikrolitresini, önceden ısıtılmış plaka üzerindeki her bir hedefe iyi bir şekilde aktarın.
Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Membran matrisini buz gibi soğuk hepatosit bakım ortamına ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Ortamı, hücreleri kapladıktan 24 saat sonra gen düzenleme analizi için belirlenen kuyucuklardan çıkarın.
Bindirme karışımını yavaşça hücrelerin üzerine pipetleyin ve plakayı 37 santigrat dereceye geri yerleştirin. Kaplamadan 24 saat sonra, şartlandırılmış ortamı MTT ve albümin tahlilleri için iyi belirlenmiş kuyudan aktarın ve albümin tahlilini gerçekleştirmeye hazır olana kadar bir mikro füj tüpünde saklayın. Genomik DNA'yı çıkararak ve metin makalesinde açıklandığı gibi PCR'yi kurarak hedef CAS dokuz aktivitesinin analizine devam edin.
Kaplamadan sonraki 3 ila 12 saat içinde hepatositler plakaya yapıştı ve hücre morfolojisi 24 saat içinde tipik bir poligonal veya altıgen görünüm kazandı İzole hücrelerin saflığı, kaplamadan 24 saat sonra periyodik asit kayma reaktifi kullanılarak glikojen boyama yoluyla doğrulandı. Lekeli hepatositlerin sitoplazması macenta olarak ortaya çıktı. Hepatositler elektroporasyondan 24 saat sonra görüntülendi ve ortalama olarak hepatositlerin %89.8'i GFP pozitifti.
Elektroporasyondan üç gün sonra CAS dokuz, analiz edilen HPD lokusunda indüklendi ve sonuçlar, CRISPR Cas dokuz mRNA ve CAS dokuz RNP için% 78.4 indel ile elektroporate hepatositlerde% 47.4'lük hedef indellerde gösterdi. MTT testi, CRISPR Cas dokuz mRNA ve R N P ile tedavi edilen hepatositlerde% 35.4 ve% 45.9 canlılık gösterdi.MTT sonuçları ile tutarlı olarak, normalize albümin seviyeleri, CAS dokuz RNA ile tedavi edilen hepatositlerde% 31.8 ve CAS dokuz r p için% 34.5 idi. Hatırlanması gereken en önemli şey, uygun kanülasyonun sonraki tüm adımları ve prosedürün başarısını etkilediğidir.
Bu işlemden sonra, hepatositler nakledilebilir ve engraftmanlarını araştırmak için fareler nakledilebilir. Ayrıca, kaplanmış hepatositlerin genomik DNA'sı, CAS dokuz düzenlemesinin verimliliğini ve özgüllüğünü analiz etmek için çıkarılabilir.
