우리 기술의 주요 장점은 시험관 내 및 생체 내 질병 모델을 생성하는 방법으로 일차 마우스 간세포에서 유전자를 편집하기 위한 쉽고 빠르며 재현 가능한 접근 방식이라는 것입니다. 우리의 기술을 사용하면 분리된 간세포에서 표적 유전자를 녹다운한 다음 환자에게 다시 이식하여 병든 세포를 유전자 편집 간세포로 대체할 수 있습니다. 경험이 부족한 연구원은 캐뉼러와 관류 내내 카테터를 안정적으로 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 사용자는 시작하기 전에 절차와 문제 해결 방법을주의 깊게 읽고 연습하는 것이 좋습니다.
간 관류 및 간세포 분리를 시연하는 것은 임상 시설 관리자 인 Tina Parker와 대학원 연구 조교 인 Ilayda Ates입니다. 전기 천공 절차는 내 실험실의 대학원 연구 조교 인 Callie Stuart가 시연 할 것입니다. 마취의 수술 평면에서.
가위를 사용하여 복부 피부에 U 자형 측면 절개를하여 간 관류를 시작하고 측면을 통해 구멍을 확장하십시오. 흉곽에 피부를 계속 엽니 다. 가위를 사용하여 복막을 잘라 복강을 흉곽까지 노출시킵니다.
장기에 흠집이 생기지 않도록주의하십시오. 집게의 뒷면이나 가위의 무딘 표면을 사용하여 내장을 오른쪽으로 움직입니다. 문맥과 하대 정맥을 확인하십시오.
펌프를 시작하여 카테터를 통해 예열된 관류 용액을 세척합니다. 펌프를 멈추고 카테터를 제거하십시오. 그런 다음 카테터에 연결된 바늘 끝을 정맥과 10-20도 각도로 하대 정맥에 삽입하고 카테터에서 바늘을 제거합니다.
그런 다음 정맥과 평행 한 움직임으로 카테터를 정맥에 부드럽게 밀어 넣습니다. 카테터를 정맥으로 더 이상 이동시키지 않고 튜브를 카테터에 연결하십시오. 분당 2 밀리리터의 유속으로 펌프를 시동하십시오.
관류가 성공했다는 신호로 간이 즉시 창백 해지는 것을 찾으십시오. 가위를 사용하여 문맥을 자릅니다. 점차적으로 유속을 분당 5 밀리리터로 증가시킵니다.
관류 용액 3이 흐르면 간의 탄력성을 주의 깊게 모니터링한다. 간이 부드러워 졌는지 확인하려면 면봉이나 집게로 간을 부드럽게 누르고 간장에 들여 쓰기가 형성되는지 확인하십시오. 세포 생존력의 손실을 피하기 위해 과도하게 관류하지 않도록주의하십시오.
30 내지 50 밀리리터의 관류 용액이 3 번 흘렀을 때 간이 부드러워지면 펌프를 멈추고 카테터와 담낭을 제거합니다. 내용물을 흘리지 않도록주의하십시오. 그런 다음 조심스럽게 간을 해부하십시오.
간을 100 % FBS 배지가있는 얼음처럼 차가운 DME M이 들어있는 10mm 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 부드럽게 휘젓고 가능한 혈전을 제거하십시오. 간을 얼음처럼 차가운 DME M과 10 % FBS 배지가 들어있는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.
간 캡슐에서 세포를 방출하려면 페트리 접시를 얼음 위에 놓은 다음 두 쌍의 멸균 집게를 사용하여 모든 엽에서 간 캡슐을 부드럽게 찢습니다. 세포 리프터를 사용하여 배지에서 간을 부드럽게 소용돌이 치며 간세포를 방출합니다. 간이 매우 작아지고 현탁액이 갈색으로 불투명해질 때까지이 동작을 계속하십시오.
플레이트에서 간 조직 잔해를 제거하고 저속으로 설정된 25 밀리리터 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 얼음 위에서 미리 냉각되고 100 마이크로 미터 세포 스트레이너가 장착 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 신선한 얼음처럼 차가운 DMEM과 10%FBS 배지를 페트리 접시에 첨가하여 표면에서 나머지 세포를 씻어내고 수집합니다. 그런 다음 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
모든 셀이 수집될 때까지 이 단계를 반복합니다. 비 실질 세포에서 간세포를 세척하고 정제하려면 섭씨 4도에서 50 RCF의 50 밀리리터 원추형 튜브에 수집 된 세포를 낮은 감속 또는 휴식없이 5 분 동안 원심 분리합니다. 파편과 비 실질 세포가 포함 된 슈퍼 나톤을 폐기하십시오.
그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이 치면서 남은 슈퍼 나톤에 펠릿을 다시 매달아 놓습니다. 펠릿 재현탁 후 30ml의 신선한 얼음처럼 차가운 DMEM과 10%FBS 배지를 추가합니다. 전기천공 장치의 전원 버튼을 켜서 CRISPR CAS 9 기질 배지, 세포 및 전기천공 기기 준비를 시작합니다.
그런 다음 프로그램 T 0 28이 화면에 나타날 때까지 X 버튼을 누른 다음 아래쪽 화살표 버튼을 눌러 전기 천공 프로그램을 설정합니다. 전기천공된 간세포에 대한 대상 웰을 6 웰 콜라겐 코팅된 플레이트에 1.5 밀리리터의 PM을 첨가하여 준비하였다. 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 37도 인큐베이터에서 플레이트를 배양하십시오.
PCR 분할 스트립 튜브에서, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 CAS 9 RMP 및 mRNA 복합체를 준비한다. 전기천공이 될 때까지 mRNA SG RNA 혼합물을 얼음에 보관하십시오. 별도로, 1 마이크로그램의 E G F P mRNA를 포함하는 튜브를 준비하여 형광 현미경을 사용하여 성공적인 전기 천공을 확인합니다.
전기천공 반응을 섭씨 4도에서 2분 동안 100 RCF에서 원심분리한다. 세포 펠릿에서 수퍼나톤을 제거하고 튜브 벽의 측면을 따라 반응당 100마이크로리터의 뉴클레오펙션 용액을 추가합니다. 다시 손으로 튜브를 부드럽게 흔들어 전기 천공 용액에 간세포를 현탁시킵니다.
간세포가 전기 천공 용액에 고르게 분산되면 100 마이크로 리터의 간세포 현탁액을 CAS 9 복합체가 들어있는 스트립 튜브로 옮깁니다. 스트립의 내용물을 전기 천공 용기로 옮깁니다. 핵-수의사 용기를 전기 천공 장치의 슬롯에 놓습니다.
X 버튼을 눌러 간세포를 전기천공합니다. 전기 천공 후 장치에 화면이 나타날 때까지 기다립니다. X 버튼을 다시 누르고 용기를 제거하십시오.
전기 천공 용기를 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오. 500 마이크로 리터의 예비 무장 PM을 전기 천공 용기에 추가하십시오. 300 마이크로리터의 전기천공 반응을 예열된 플레이트 상의 각 목적지 웰로 옮깁니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 멤브레인 매트릭스를 얼음처럼 차가운 간세포 유지 배지에 넣고 위아래로 10 번 피펫팅하여 혼합합니다. 세포를 플레이팅한 후 24시간 후에 유전자 편집 분석을 위해 지정된 웰로부터 배지를 제거한다.
오버레이 혼합물을 셀 위에 천천히 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에 다시 놓습니다. 도금 후 24시간에, MTT 및 알부민 분석을 위해 지정된 웰로부터 컨디셔닝 배지를 옮기고, 알부민 분석을 수행할 준비가 될 때까지 마이크로-퓨지 튜브에 보관한다. 게놈 DNA를 추출하고 텍스트 원고에 설명된 대로 PCR을 설정하여 표적 CAS 9 활성의 분석을 진행합니다.
도금 후 3 내지 12시간 이내에 플레이트에 부착된 간세포와 세포 형태는 24시간 이내에 전형적인 다각형 또는 육각형 모양을 취하고, 분리된 세포의 순도는 도금 후 24시간에 주기적인 산 이동 시약을 사용한 글리코겐 염색을 통해 확인하였다. 염색 된 간세포의 세포질은 자홍색으로 나타났다. 간세포는 전기 천공 후 24 시간 후에 이미징되었으며 평균적으로 간세포의 89.8 %가 GFP 양성이었습니다.
전기천공 후 3일째에 HPD 유전자좌에서 유도된 CAS 9를 분석한 결과, CRISPR Cas 9 mRNA로 전기천공된 간세포에서 47.4%의 표적 인델과 CAS 9 RNP에 대해 78.4%인델을 나타낸 결과를 보였다. MTT 분석은 CRISPR Cas 9 mRNA 및 RNP로 처리 된 간세포에서 35.4 % 및 45.9 %의 생존율을 보였다.MTT 결과와 일치하여 정상화 된 알부민 수치는 CAS 9 RNA로 처리 된 간세포에서 31.8 %, CAS 9 r p에서 34.5 %였다. 기억해야 할 가장 중요한 점은 적절한 캐뉼레이션이 모든 이후 단계와 절차의 성공에 영향을 미친다는 것입니다.
이 절차 후에 간세포를 이식하고 생쥐를 이식하여 생착을 조사 할 수 있습니다. 또한, 도금 된 간세포의 게놈 DNA를 추출하여 CAS 9 편집의 효율성과 특이성을 분석 할 수 있습니다.
