Le principal avantage de notre technique est qu’il s’agit d’une approche facile, rapide et reproductible pour modifier les gènes dans les hépatocytes primaires de souris afin de générer des modèles de maladies in vitro et in vivo. En utilisant notre technique, il peut être possible d’abattre un gène cible dans des hépatocytes isolés, puis de les transplanter chez le patient, pour remplacer les cellules malades par des hépatocytes génétiquement modifiés. Il est conseillé aux utilisateurs de lire attentivement et de pratiquer la procédure et les méthodes de dépannage avant de commencer.
Tina Parker, gestionnaire d’établissement clinique, et Ilayda Ates, assistante de recherche diplômée, feront la démonstration de la perfusion hépatique et de l’isolement des hépatocytes. La procédure d’électroporation sera démontrée par Callie Stuart, une assistante de recherche diplômée de mon laboratoire. Sous un plan chirurgical d’anesthésie.
Commencez la perfusion hépatique en faisant une incision latérale en forme de U dans la peau de l’abdomen à l’aide de ciseaux et élargissez le trou sur les côtés. Continuez à ouvrir la peau de la cage thoracique. À l’aide de ciseaux, coupez à travers le péritoine pour exposer la cavité abdominale jusqu’à la cage thoracique.
Attention à ne pas entailler les organes. Déplacez les intestins vers le côté droit à l’aide de l’arrière des forceps ou de la surface émoussée des ciseaux. Identifier la veine porte et la veine cave inférieure.
Démarrez la pompe pour rincer la solution de perfusion préchauffée à travers le cathéter. Arrêtez la pompe et retirez le cathéter. Insérez ensuite la pointe de l’aiguille reliée au cathéter dans la veine cave inférieure à un angle de 10 à 20 degrés par rapport à la veine, retirez l’aiguille du cathéter.
Poussez ensuite doucement le cathéter dans la veine dans un mouvement parallèle à la veine. Connectez le tube au cathéter sans déplacer le cathéter plus loin dans la veine. Démarrez la pompe avec un débit de deux millilitres par minute.
Recherchez le foie qui pâlit immédiatement comme un signe que la perfusion est réussie. Couper la veine porte à l’aide de ciseaux. Augmentez progressivement le débit à cinq millilitres par minute.
Une fois que la solution de perfusion trois circule, surveillez attentivement l’élasticité du foie. Pour déterminer si le foie s’est ramolli, appuyez doucement sur le foie avec un coton-tige ou une pince et vérifiez si des indentations se forment sur le foie. Attention à ne pas trop perfuser pour éviter la perte de viabilité cellulaire.
Une fois que le foie se ramollit après 30 à 50 millilitres de solution de perfusion trois a coulé, arrêtez la pompe, retirez le cathéter et la vésicule biliaire. Attention à ne pas renverser son contenu. Ensuite, disséquez soigneusement le foie.
Placez le foie dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant du DME M glacé avec 10% FBS moyen. Remuez doucement la boîte de Petri pour éliminer les éventuels caillots sanguins. Transférer le foie dans une nouvelle boîte de Petri contenant du DME M glacé et 10% FBS milieu.
Pour libérer les cellules de la capsule hépatique, placez la boîte de Petri sur de la glace, puis à l’aide de deux paires de pinces stériles, déchirez doucement la capsule hépatique sur tous les lobes. Faites tourner doucement le foie dans le milieu à l’aide d’un élévateur cellulaire pour libérer les hépatocytes. Continuez ce mouvement jusqu’à ce que le foie devienne très petit et que la suspension devienne brune et opaque.
Retirez les restes de tissu hépatique de la plaque et, à l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres réglée à basse vitesse, transférez soigneusement la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres prérefroidi sur glace et équipé d’une crépine cellulaire de 100 micromètres. Ajouter du DMEM frais glacé et 10% de milieu FBS à la boîte de Petri pour laver et recueillir les cellules restantes de la surface. Ensuite, transférer dans le tube conique de 50 millilitres.
Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les cellules soient collectées. Pour laver et purifier les hépatocytes des cellules non parenchymateuses, centrifuger les cellules recueillies dans le tube conique de 50 millilitres à 50 RCF à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes à faible décélération ou sans interruption. Jetez le super-naton contenant des débris et des cellules non parenchymateuses.
Ensuite, remettez en suspension la pastille dans le super-naton restant en faisant tourner doucement le tube. Après la remise en suspension des granulés, ajoutez 30 millilitres de DMEM frais glacé et 10% FBS moyen. Commencez à préparer les substrats CRISPR CAS 9, les cellules et l’instrument d’électroporation en allumant le bouton d’alimentation du dispositif d’électroporation.
Réglez ensuite le programme d’électroporation en appuyant sur le bouton X, puis sur le bouton flèche bas jusqu’à ce que le programme T 0 28 apparaisse à l’écran. Préparation des puits de destination pour les hépatocytes électroporés en ajoutant 1,5 millilitre de PM à six plaques enrobées de collagène de puits. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
Dans les tubes à bandelettes fendues par PCR, préparer les complexes CAS 9 RMP et ARNm tels que décrits dans le manuscrit textuel. Conservez le mélange d’ARN sg sur de la glace jusqu’à électroporation. Préparer séparément un tube contenant un microgramme d’ARNm E G F P pour vérifier la réussite de l’électroporation à l’aide de la microscopie à fluorescence.
Centrifuger la réaction d’électroporation à 100 RCF pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le supernaton de la pastille cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution de nucléoffection par réaction le long du côté de la paroi du tube. Remettre en suspension les hépatocytes dans la solution d’électroporation en balançant doucement le tube à la main.
Une fois que les hépatocytes sont uniformément dispersés dans la solution d’électroporation, transférer 100 microlitres de la suspension hépatocytes dans les tubes de bande contenant les neuf complexes CAS. Transférer le contenu de la bande bien dans un récipient d’électroporation. Placez le vaisseau nucléo-vétérinaire dans la fente du dispositif d’électroporation.
Électroporate les hépatocytes en appuyant sur le bouton X. Après l’électroporation, attendez qu’un écran apparaisse sur l’appareil qui dit:OK. Appuyez à nouveau sur le bouton X et retirez le récipient.
Incuber le récipient électroporé sur de la glace pendant 15 minutes. Ajouter 500 microlitres à un PM armé de la poignée dans le récipient d’électroporation. Transférer 300 microlitres de la réaction d’électroporation à chaque puits de destination sur la plaque préchauffée.
Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ajouter la matrice membranaire au milieu d’entretien des hépatocytes glacés et mélanger en pipetant de haut en bas 10 fois. Retirer le milieu des puits désignés pour l’analyse de l’édition de gènes 24 heures après le placage des cellules.
Pipeter le mélange de superposition lentement sur les cellules et replacer la plaque à 37 degrés Celsius. 24 heures après le placage, transférer le milieu conditionné du puits désigné pour les dosages MTT et albumine et conserver dans un tube micro-fuge jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer le dosage de l’albumine. Procéder à l’analyse de l’activité CAS neuf sur cible en extrayant l’ADN génomique et en mettant en place la PCR comme décrit dans le manuscrit texte.
Dans les 3 à 12 heures suivant le placage, les hépatocytes ont adhéré à la plaque et la morphologie cellulaire a pris un aspect polygonal ou hexagonal typique dans les 24 heures La pureté des cellules isolées a été vérifiée par coloration au glycogène à l’aide du réactif périodique de décalage acide 24 heures après le placage. Le cytoplasme des hépatocytes colorés est apparu magenta. Les hépatocytes ont été imagés 24 heures après l’électroporation et en moyenne, 89,8% des hépatocytes étaient positifs à la GFP.
Trois jours après l’électroporation, CAS neuf induit dans le locus HPD a été analysé et les résultats ont montré sur la cible des indels de 47,4% dans les hépatocytes électroporés avec CRISPR Cas neuf ARNm et 78,4% indels pour le CAS neuf RNP. Le test MTT a montré une viabilité de 35,4 et 45,9% dans les hépatocytes traités avec CRISPR Cas neuf ARNm et R N P.Conformément aux résultats MTT, les taux d’albumine normalisés étaient de 31,8% dans les hépatocytes traités avec CAS nine RNA et de 34,5% pour CAS nine r p. La chose la plus importante à retenir est que la canulation appropriée affecte toutes les étapes ultérieures et le succès de la procédure.
Après cette procédure, les hépatocytes peuvent être transplantés et les souris à enquêter sur leurs greffes. De plus, l’ADN génomique des hépatocytes plaqués peut être extrait pour analyser l’efficacité et la spécificité de l’édition CAS nine.
