Основным преимуществом нашей методики является то, что это простой, быстрый и воспроизводимый подход к редактированию генов в первичных гепатоцитах мышей как способ генерации моделей заболеваний in vitro и in vivo. Используя нашу технику, можно сбить ген-мишень в изолированных гепатоцитах, а затем пересадить их обратно пациенту, чтобы заменить больные клетки генетически отредактированными гепатоцитами Неопытные исследователи могут бороться с канюляцией и поддержанием катетера устойчивым на протяжении всей перфузии. Пользователям рекомендуется внимательно прочитать и попрактиковаться в процедуре и методах устранения неполадок перед началом работы.
Продемонстрировать перфузию печени и выделение гепатоцитов будут Тина Паркер, менеджер клинического учреждения, и Илайда Атес, аспирант-научный сотрудник. Процедуру электропорации продемонстрирует Калли Стюарт, аспирант моей лаборатории. Под хирургическим контуром анестезии.
Начните перфузию печени, сделав U-образный боковой разрез в коже живота с помощью ножниц, и расширьте отверстие через стороны. Продолжайте открывать кожу к грудной клетке. С помощью ножниц прорежьте брюшину, чтобы обнажить брюшную полость до грудной клетки.
Будьте осторожны, чтобы не проколоть какие-либо органы. Переместите кишечник в правую сторону с помощью задней части щипцов или тупой поверхности ножниц. Выявляют воротную вену и нижнюю полую вену.
Запустите насос для промывки предварительно подогретого перфузионного раствора через катетер. Остановите насос и извлеките катетер. Затем вставьте кончик иглы, соединенной с катетером, в нижнюю полую вену под углом от 10 до 20 градусов к вене, извлеките иглу из катетера.
Затем осторожно протолкните катетер в вену движением, параллельным вене. Подключите трубку к катетеру, не перемещая катетер дальше в вену. Запустите насос со скоростью потока два миллилитра в минуту.
Ищите печень, которая сразу же бледнеет как признак того, что перфузия успешна. Вырежьте воротную вену ножницами. Постепенно увеличивайте скорость потока до пяти миллилитров в минуту.
После того, как перфузионный раствор три протекает насквозь, тщательно контролируйте эластичность печени. Чтобы определить, размягчилась ли печень, осторожно надавите на печень ватным тампоном или щипцами и проверьте, образуются ли на печени углубления. Будьте осторожны, чтобы не переусердствовать, чтобы избежать потери жизнеспособности клеток.
После того, как печень размягчается после 30-50 миллилитров перфузионного раствора, три протекают, останавливают насос, удаляют катетер и желчный пузырь. Следите за тем, чтобы не пролить его содержимое. Затем тщательно рассекают печень.
Поместите печень в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной DME M с 10% средой FBS. Осторожно закрутите чашку Петри, чтобы удалить возможные сгустки крови. Переведите печень в новую чашку Петри, содержащую ледяной DME M и 10% FBS среду.
Чтобы освободить клетки из капсулы печени, поместите чашку Петри на лед, затем, используя две пары стерильных щипцов, аккуратно разорвите капсулу печени на всех долях. Осторожно вращайте печень в среде, используя клеточный лифтер, чтобы освободить гепатоциты. Продолжайте это движение до тех пор, пока печень не станет очень маленькой, а суспензия не станет коричневой и непрозрачной.
Удалите остатки ткани печени из пластины и, используя 25-миллилитровую серологическую пипетку, установленную на низкую скорость, осторожно перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров, предварительно охлажденную на льду и оснащенную 100-микрометровым клеточным сетчатым фильтром. Добавьте свежий ледяной холодный DMEM и 10% среды FBS в чашку Петри, чтобы вымыть и собрать оставшиеся клетки с поверхности. Затем переведите на 50-миллилитровую коническую трубку.
Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут собраны все ячейки. Чтобы промыть и очистить гепатоциты от непаренхимальных клеток, центрифугируют клетки, собранные в конической трубке объемом 50 миллилитров при 50 RCF при четырех градусах Цельсия, в течение пяти минут при низком замедлении или без каких-либо перерывов. Выбросьте супер-натон, содержащий мусор и непаренхиматозные клетки.
Затем повторно приостановите гранулу в оставшемся супер-натоне, осторожно закрутив трубку. После гранул повторной суспензии добавляют 30 миллилитров свежего ледяного холодного DMEM и 10% среды FBS. Начните подготовку среды подложек CRISPR CAS 9, ячеек и электропорационного прибора, включив кнопку питания на электропорационном устройстве.
Затем установите программу электропорации, нажав кнопку X, а затем кнопку со стрелкой вниз, пока программа T 0 28 не появится на экране. Подготовили целевые лунки для электропорированных гепатоцитов, добавив 1,5 миллилитра ПМ к шести коллагеновым колодцам на одну пластину, покрытую оболочкой. Инкубируйте пластины в инкубаторе с температурой 37 градусов цельсия до готовности к использованию.
В ПЦР расщепленных ленточных трубках подготовьте комплексы CAS 9 RMP и мРНК, как описано в текстовой рукописи. Храните смесь РНК мРНК SG на льду до электропорации. Отдельно подготовьте трубку, содержащую один микрограмм E G F P мРНК для проверки успешной электропорации с помощью флуоресцентной микроскопии.
Центрифугируйте реакцию электропорации при 100 RCF в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатон из гранулы ячейки и добавьте 100 микролитров раствора нуклеофекции на реакцию вдоль боковой стенки трубки. Суспендировать гепатоциты в растворе электропорации, осторожно раскачивая трубку вручную.
Как только гепатоциты равномерно диспергируются в электропорационном растворе, перенесите 100 микролитров суспензии гепатоцитов в полосковые трубки, содержащие девять комплексов CAS. Перенесите содержимое полосы хорошо в электропорационный сосуд. Поместите сосуд нуклеовета в щель на электропорационном устройстве.
Электропорат гепатоцитов нажатием кнопки X. После электропорации подождите, пока на устройстве появится экран с надписью: «Хорошо. Нажмите кнопку X еще раз и извлеките сосуд.
Инкубируйте электропорированное судно на льду в течение 15 минут. Добавьте 500 микролитров в электропорационный сосуд. Перенесите 300 микролитров реакции электропорации в каждый пункт назначения хорошо на предварительно нагретой пластине.
Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов цельсия. Добавьте мембранную матрицу в ледяную поддерживающую среду гепатоцитов и перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Удалите среду из лунок, предназначенных для анализа редактирования генов через 24 часа после покрытия клеток.
Пипетка накладывает смесь медленно поверх ячеек и помещает пластину обратно при 37 градусах Цельсия. Через 24 часа после нанесения покрытия переложите кондиционированную среду из хорошо предназначенной для анализа МТТ и альбумина и храните в микрофуге-трубке до готовности к выполнению анализа альбумина. Приступайте к анализу активности девяти целевых CAS путем извлечения геномной ДНК и настройки ПЦР, как описано в тексте рукописи.
В течение 3-12 часов после покрытия гепатоциты прилипали к пластине, и морфология клеток предполагала типичный полигональный или гексагональный вид в течение 24 часов Чистота изолированных клеток была проверена путем окрашивания гликогеном с использованием периодического реагента кислотного сдвига через 24 часа после покрытия. Цитоплазма окрашенных гепатоцитов оказалась пурпурной. Гепатоциты были сфотографированы через 24 часа после электропорации, и в среднем 89,8% гепатоцитов были положительными на GFP.
Через три дня после электропорации CAS девять индуцировали в локусе HPD, где анализировали и результаты показали на целевых инделях 47,4% в гепатоцитах, электропорированных с помощью CRISPR Cas девять мРНК и 78,4% indels для CAS девять RNP. Анализ MTT показал 35,4 и 45,9% жизнеспособности в гепатоцитах, обработанных CRISPR Cas девять мРНК и R N P. В соответствии с результатами MTT нормализованные уровни альбумина составили 31,8% в гепатоцитах, обработанных CAS девять РНК, и 34,5% для CAS девять r p. Самое главное, что нужно помнить, это то, что правильная каннуляция влияет на все последующие этапы и успех процедуры.
После этой процедуры гепатоциты могут быть пересажены, а мыши исследовать их приживление. Кроме того, геномная ДНК покрытых гепатоцитов может быть извлечена для анализа эффективности и специфичности редактирования CAS nine.
