Il vantaggio principale della nostra tecnica è che si tratta di un approccio facile, veloce e riproducibile per la modifica dei geni negli epatociti primari di topo come un modo per generare modelli di malattia in vitro e in vivo. Utilizzando la nostra tecnica, potrebbe essere possibile abbattere un gene bersaglio in epatociti isolati e quindi trapiantarli di nuovo nel paziente, per sostituire le cellule malate con epatociti geneticamente modificati I ricercatori inesperti potrebbero lottare con l'incannulamento e mantenere il catetere stabile durante la perfusione. Si consiglia agli utenti di leggere attentamente e praticare la procedura e i metodi di risoluzione dei problemi prima di iniziare.
A dimostrare la perfusione epatica e l'isolamento degli epatociti saranno Tina Parker, responsabile della struttura clinica, e Ilayda Ates, assistente di ricerca laureata. La procedura di elettroporazione sarà dimostrata da Callie Stuart, un'assistente di ricerca laureata del mio laboratorio. Sotto un piano chirurgico di anestesia.
Iniziare la perfusione epatica facendo un'incisione laterale a forma di U nella pelle dell'addome usando le forbici ed espandere il foro attraverso i lati. Continuare ad aprire la pelle alla gabbia toracica. Usando le forbici, tagliare il peritoneo per esporre la cavità addominale fino alla gabbia toracica.
Fare attenzione a non intaccare alcun organo. Sposta l'intestino sul lato destro usando il dorso del forcipe o la superficie smussata delle forbici. Identificare la vena porta e la vena cava inferiore.
Avviare la pompa per lavare la soluzione di perfusione preriscaldata attraverso il catetere. Arrestare la pompa e rimuovere il catetere. Quindi inserire la punta dell'ago collegata al catetere nella vena cava inferiore con un angolo da 10 a 20 gradi rispetto alla vena, rimuovere l'ago dal catetere.
Quindi spingere delicatamente il catetere nella vena in un movimento parallelo alla vena. Collegare il tubo al catetere senza spostare ulteriormente il catetere nella vena. Avviare la pompa con una portata di due millilitri al minuto.
Cerca che il fegato diventi immediatamente pallido come segno che la perfusione ha successo. Taglia la vena porta usando le forbici. Aumentare gradualmente la portata a cinque millilitri al minuto.
Una volta che la soluzione di perfusione tre scorre attraverso monitorare attentamente l'elasticità del fegato. Per determinare se il fegato si è ammorbidito, premere delicatamente il fegato con un batuffolo di cotone o una pinza e verificare se si formano rientranze sul fegato. Fare attenzione a non perfondere eccessivamente per evitare la perdita di vitalità cellulare.
Una volta che il fegato si ammorbidisce dopo 30-50 millilitri di soluzione di perfusione, tre è fluito attraverso, fermare la pompa, rimuovere il catetere e la cistifellea. Attenzione a non rovesciare il suo contenuto. Quindi sezionare attentamente il fegato.
Posizionare il fegato in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente DME M ghiacciato con mezzo FBS al 10%. Ruotare delicatamente la piastra di Petri per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Trasferire il fegato in una nuova capsula di Petri contenente DME M ghiacciato e mezzo FBS al 10%.
Per liberare le cellule dalla capsula epatica, posizionare la capsula di Petri sul ghiaccio, quindi utilizzando due paia di pinze sterili, strappare delicatamente la capsula epatica su tutti i lobi. Ruotare delicatamente il fegato nel mezzo usando un sollevatore cellulare per rilasciare gli epatociti. Continuare questo movimento fino a quando il fegato diventa molto piccolo e la sospensione diventa marrone e opaca.
Rimuovere i resti di tessuto epatico dalla piastra e utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri impostata a bassa velocità, trasferire con cautela la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri pre-raffreddato su ghiaccio e dotato di un filtro cellulare da 100 micrometri. Aggiungere DMEM ghiacciato fresco e 10% di terreno FBS alla capsula di Petri per lavare e raccogliere le cellule rimanenti dalla superficie. Quindi, trasferire sul tubo conico da 50 millilitri.
Ripetere questo passaggio fino a raccogliere tutte le celle. Per lavare e purificare gli epatociti da cellule non parenchimali, centrifugare le cellule raccolte nel tubo conico da 50 millilitri a 50 RCF a quattro gradi Celsius per cinque minuti a bassa decelerazione o senza interruzioni. Scartare il super-naton contenente detriti e cellule non parenchimali.
Quindi risospendere il pellet nel super-naton rimanente ruotando delicatamente il tubo. Dopo la risospensione del pellet aggiungere 30 millilitri di DMEM fresco ghiacciato e il 10% di mezzo FBS. Iniziare a preparare il supporto dei substrati CRISPR CAS 9, le celle e lo strumento di elettroporazione accendendo il pulsante di accensione sul dispositivo di elettroporazione.
Quindi impostare il programma di elettroporazione premendo il pulsante X e quindi il pulsante freccia giù fino a quando il programma T 0 28 appare sullo schermo. Preparato i pozzetti di destinazione per gli epatociti elettroporati aggiungendo 1,5 millilitri di PM a sei piastre rivestite di collagene a segno. Incubare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso.
In provette split strip PCR, preparare i complessi CAS 9 RMP e mRNA come descritto nel manoscritto testuale. Conservare la miscela di mRNA SG RNA su ghiaccio fino all'elettroporazione. Separatamente, preparare una provetta contenente un microgrammo di mRNA E G F P per verificare il successo dell'elettroporazione utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Centrifugare la reazione di elettroporazione a 100 RCF per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernaton dal pellet cellulare e aggiungere 100 microlitri di soluzione nucleoffection per reazione lungo il lato della parete del tubo. Risospendere gli epatociti nella soluzione di elettroporazione facendo oscillare delicatamente il tubo a mano.
Una volta che gli epatociti sono uniformemente dispersi nella soluzione di elettroporazione, trasferire 100 microlitri della sospensione di epatociti ai tubi a striscia contenenti i nove complessi CAS. Trasferire il contenuto del pozzetto della striscia in un recipiente di elettroporazione. Posizionare il recipiente nucleo-vet nella fessura del dispositivo di elettroporazione.
Elettroporare gli epatociti premendo il pulsante X. Dopo l'elettroporazione, attendi che sul dispositivo venga visualizzata una schermata che dice: Ok. Premere nuovamente il pulsante X e rimuovere il recipiente.
Incubare il vaso elettropolato sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere 500 microlitri di PM al recipiente di elettroporazione. Trasferire 300 microlitri della reazione di elettroporazione a ciascuna destinazione pozzetto sulla piastra preriscaldata.
Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere la matrice della membrana al mezzo di mantenimento degli epatociti ghiacciati e mescolare pipettando su e giù 10 volte. Rimuovere il mezzo dai pozzetti designati per l'analisi di editing genetico 24 ore dopo aver placcato le cellule.
Pipettare lentamente la miscela sovrapposta sopra le celle e riposizionare la piastra a 37 gradi Celsius. A 24 ore dalla placcatura, trasferire il mezzo condizionato dal pozzo designato per i saggi MTT e albumina e conservare in una provetta microfuga fino al momento di eseguire il test dell'albumina. Procedere con l'analisi dell'attività target CAS nove estraendo il DNA genomico e impostando la PCR come descritto nel manoscritto testuale.
Entro 3-12 ore dalla placcatura gli epatociti hanno aderito alla piastra e la morfologia cellulare ha assunto un tipico aspetto poligonale o esagonale entro 24 ore La purezza delle cellule isolate è stata verificata tramite colorazione con glicogeno utilizzando il reagente periodico di spostamento acido a 24 ore dopo la placcatura. Il citoplasma degli epatociti colorati appariva magenta. Gli epatociti sono stati sottoposti a imaging 24 ore dopo l'elettroporazione e, in media, l'89,8% degli epatociti era positivo alla GFP.
A tre giorni dopo l'elettroporazione CAS nove indotte nel locus HPD sono state analizzate e i risultati hanno mostrato su indels target del 47,4% negli epatociti elettroporati con CRISPR Cas nove mRNA e 78,4% indels per il CAS nove RNP. Il test MTT ha mostrato una vitalità del 35,4% e del 45,9% negli epatociti trattati con CRISPR Cas nove mRNA e R N P.Coerentemente con i risultati MTT, i livelli normalizzati di albumina erano del 31,8% negli epatociti trattati con CAS nove RNA e del 34,5% per CAS nove r p. La cosa più importante da ricordare è che un corretto incannulamento influisce su tutti i passaggi successivi e sul successo della procedura.
Dopo questa procedura, gli epatociti possono essere trapiantati e topi per studiare i loro attecchimenti. Inoltre, il DNA genomico degli epatociti placcati può essere estratto per analizzare l'efficienza e la specificità dell'editing CAS nine.
