الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها نهج سهل وسريع وقابل للتكرار لتحرير الجينات في خلايا الكبد الأولية للفئران كوسيلة لتوليد نماذج الأمراض في المختبر وفي الجسم الحي. باستخدام تقنيتنا ، قد يكون من الممكن هدم جين مستهدف في خلايا الكبد المعزولة ثم زرعها مرة أخرى في المريض ، لاستبدال الخلايا المريضة بخلايا الكبد المعدلة جينيا قد يكافح الباحثون عديمي الخبرة مع القنية والحفاظ على القسطرة ثابتة طوال فترة التروية. ينصح المستخدمون بقراءة الإجراء وطرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها بعناية وممارستها قبل البدء.
ومن بين المشاركين في عملية تروية الكبد وعزل خلايا الكبد تينا باركر مديرة منشأة سريرية وإيليدا آتيس، مساعدة باحث دراسات عليا. سيتم عرض إجراء الفحص الكهربائي من قبل كالي ستيوارت ، مساعد أبحاث الدراسات العليا من مختبري. تحت طائرة جراحية من التخدير.
ابدأ تروية الكبد عن طريق إجراء شق جانبي على شكل حرف U في جلد البطن باستخدام المقص ، وقم بتوسيع الثقب عبر الجانبين. استمر في فتح الجلد إلى القفص الصدري. باستخدام المقص ، قم بقطع الصفاق لفضح تجويف البطن حتى القفص الصدري.
الحرص على عدم أي أعضاء. حرك الأمعاء إلى الجانب الأيمن باستخدام الجزء الخلفي من الملقط أو السطح الحاد للمقص. تحديد الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي.
ابدأ تشغيل المضخة لطرد محلول التروية المسخن مسبقا من خلال القسطرة. أوقف المضخة وأزل القسطرة. ثم أدخل طرف الإبرة المتصلة بالقسطرة في الوريد الأجوف السفلي بزاوية 10 إلى 20 درجة إلى الوريد ، وقم بإزالة الإبرة من القسطرة.
ثم ادفع القسطرة برفق إلى الوريد في حركة موازية للوريد. قم بتوصيل الأنبوب بالقسطرة دون تحريك القسطرة أكثر في الوريد. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق يبلغ ملليلترين في الدقيقة.
ابحث عن الكبد الذي يتحول على الفور إلى شاحب كعلامة على نجاح التروية. قطع الوريد البوابة باستخدام مقص. زيادة معدل التدفق تدريجيا إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة.
بمجرد أن يتدفق محلول التروية ثلاثة من خلال مراقبة مرونة الكبد بعناية. لتحديد ما إذا كان الكبد قد خفف ، اضغط برفق على الكبد باستخدام قطعة قطن أو ملقط وتحقق مما إذا كانت المسافات البادئة تتشكل على الكبد. احرص على عدم الإفراط في النفاذية لتجنب فقدان صلاحية الخلايا.
بمجرد أن يلين الكبد بعد تدفق 30 إلى 50 ملليلتر من محلول التروية الثلاثة ، أوقف المضخة ، وأزل القسطرة والمرارة. الحرص على عدم انسكاب محتوياته. ثم تشريح الكبد بعناية.
ضع الكبد في طبق بتري 100 ملم يحتوي على الثلج البارد DME M مع 10٪ FBS متوسطة. قم بتدوير طبق بتري بلطف لإزالة جلطات الدم المحتملة. انقل الكبد إلى طبق بتري جديد يحتوي على الثلج البارد DME M و 10٪ FBS المتوسط.
لإطلاق الخلايا من كبسولة الكبد ، ضع طبق بتري على الثلج ثم باستخدام زوجين من الملقط المعقم ، قم بتمزيق كبسولة الكبد بلطف على جميع الفصوص. قم بتدوير الكبد بلطف في الوسط باستخدام رافع الخلايا لإطلاق خلايا الكبد. استمر في هذه الحركة حتى يصبح الكبد صغيرا جدا ويتحول التعليق إلى اللون البني وغير الشفاف.
قم بإزالة بقايا أنسجة الكبد من الصفيحة وباستخدام ماصة مصلية سعة 25 ملليلتر مضبوطة على سرعة منخفضة ، انقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد ومزود بمصفاة خلية 100 ميكرومتر. أضف الثلج البارد الطازج DMEM ، و 10٪ FBS متوسطة إلى طبق بتري لغسل وجمع الخلايا المتبقية من السطح. ثم ، نقل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
كرر هذه الخطوة حتى يتم تجميع كافة الخلايا. لغسل وتنقية خلايا الكبد من الخلايا غير المتنية ، قم بالطرد المركزي للخلايا التي تم جمعها في الأنبوب المخروطي 50 ملليلتر عند 50 RCF عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق عند تباطؤ منخفض أو بدون أي فواصل. تخلص من الناتون الفائق الذي يحتوي على حطام وخلايا غير متنيمة.
ثم أعد تعليق الكريات في بقايا الناتون الفائق عن طريق تدوير الأنبوب بلطف. بعد إعادة تعليق الكريات ، أضف 30 ملليلتر من DMEM البارد الطازج و 10٪ FBS متوسطة. ابدأ في إعداد وسائط ركائز CRISPR CAS 9 والخلايا وأداة الكهربية عن طريق تشغيل زر الطاقة على جهاز الكهرب.
ثم قم بتعيين برنامج الكهربية عن طريق الضغط على زر X ثم زر السهم لأسفل حتى يظهر البرنامج T 0 28 على الشاشة. أعدت الآبار المقصودة لخلايا الكبد الكهربائية عن طريق إضافة 1.5 ملليلتر من PM إلى ستة ألواح مغلفة بالكولاجين بشكل جيد. احتضن الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
في أنابيب الشريط المنقسم PCR ، قم بإعداد مجمعات CAS 9 RMP و mRNA كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بتخزين مزيج MRNA SG RNA على الثلج حتى يتم وضعه بالكهرباء. بشكل منفصل ، قم بإعداد أنبوب يحتوي على ميكروغرام واحد من E G F P mRNA للتحقق من نجاح الكهربية باستخدام المجهر الفلوري.
الطرد المركزي تفاعل الكهربية عند 100 RCF لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة supernaton من حبيبة الخلية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول nucleoffection لكل تفاعل على طول جانب جدار الأنبوب. أعد تعليق خلايا الكبد في محلول الكهربية عن طريق هز الأنبوب بلطف باليد.
بمجرد تشتت خلايا الكبد بالتساوي في محلول الكهربية ، قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى أنابيب الشريط التي تحتوي على مجمعات CAS التسعة. انقل محتويات الشريط جيدا إلى وعاء كهربائي. ضع وعاء النواة البيطرية في الفتحة الموجودة على جهاز التفريغ الكهربائي.
قم بإلكتروبو خلايا الكبد عن طريق الضغط على الزر X. بعد الكهربية ، انتظر حتى تظهر شاشة منبثقة على الجهاز تقول: حسنا. اضغط على الزر X مرة أخرى وقم بإزالة السفينة.
احتضن الوعاء الكهربائي على الجليد لمدة 15 دقيقة. أضف 500 ميكرولتر من PM المسلح مسبقا إلى وعاء الكهروبوراتيون. انقل 300 ميكرولتر من تفاعل الكهربية إلى كل وجهة بشكل جيد على اللوحة الدافئة مسبقا.
احتضان الألواح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. أضف مصفوفة الغشاء إلى وسط صيانة خلايا الكبد الباردة على الثلج واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات. قم بإزالة الوسط من الآبار المخصصة لتحليل تحرير الجينات بعد 24 ساعة من طلاء الخلايا.
ماصة خليط التراكب ببطء فوق الخلايا ووضع اللوحة مرة أخرى عند 37 درجة مئوية. في غضون 24 ساعة بعد الطلاء ، انقل الوسط المشروط من البئر المخصص لفحوصات MTT والألبومين وخزنه في أنبوب صغير حتى يصبح جاهزا لإجراء فحص الألبومين. المضي قدما في تحليل النشاط التاسع المستهدف في CAS عن طريق استخراج الحمض النووي الجيني وإعداد PCR كما هو موضح في مخطوطة النص.
في غضون 3 إلى 12 ساعة من الطلاء ، التصقت خلايا الكبد باللوحة وافترض مورفولوجيا الخلية مظهرا مضلعا أو سداسيا نموذجيا في غضون 24 ساعة تم التحقق من نقاء الخلايا المعزولة عن طريق تلطيخ الجليكوجين باستخدام كاشف التحول الحمضي الدوري في 24 ساعة بعد الطلاء. ظهر السيتوبلازم من خلايا الكبد الملطخة أرجوانيا. تم تصوير خلايا الكبد بعد 24 ساعة من المعالجة الكهربائية وفي المتوسط ، كانت 89.8٪ من خلايا الكبد إيجابية GFP.
في ثلاثة أيام بعد الحفر الكهربائي CAS تسعة المستحثة في موضع HPD حيث تم تحليلها وأظهرت النتائج على indels المستهدفة من 47.4 ٪ في خلايا الكبد الكهربائية مع كريسبر كاس تسعة mRNA و 78.4 ٪ indels ل CAS تسعة RNP. أظهر فحص MTT قابلية 35.4 و 45.9٪ في خلايا الكبد المعالجة ب CRISPR Cas nine mRNA و R N P.تمشيا مع نتائج MTT ، كانت مستويات الألبومين الطبيعية 31.8٪ في خلايا الكبد المعالجة ب CAS nine RNA و 34.5٪ ل CAS nine R p. أهم شيء يجب تذكره هو أن القنية المناسبة تؤثر على جميع الخطوات اللاحقة ونجاح الإجراء.
بعد هذا الإجراء ، يمكن زرع خلايا الكبد والفئران للتحقيق في تطعيماتها. علاوة على ذلك ، يمكن استخراج الحمض النووي الجينومي لخلايا الكبد المطلية لتحليل كفاءة وخصوصية تحرير CAS Nine.
