该协议降低了从结核分枝杆菌，Mtb EVs富集细胞外囊泡所需的技术复杂性和时间。它为传统的超速离心和基于密度的技术提供了一种温和的替代方案。这种技术的主要优点是易于执行，使其更具可重复性。
它提供了高产量的Mtb EV，具有最少的非EV蛋白共富集。演示该程序的将是Joanie Ryan，我们实验室的前研究生。首先，通过添加PBS的全部体积容量来制备100千道尔顿分子量截止离心过滤器。
在4摄氏度下以2， 800倍G离心5分钟。丢弃流通物和任何剩余的PBS，并用Mtb CFP填充样品室至最大容量。在4摄氏度下以2， 800倍G离心，直到体积减小到超滤装置的最小体积。
根据需要重复，直到整个样品充分减少。向含有浓缩物的过滤单元中添加 1X PBS，直至达到设备总容量。如前所述减少体积，重复此步骤五次，以确保完全洗涤和缓冲液更换。
然后，根据超滤装置规格回收100千道尔顿浓缩CFP截留物或100R。用最小体积的1X PBS清洗过滤器至少三次，并用100R拉洗以最大限度地提高回收率。在PBS中使用几种稀释的样品，并用bicinchoninic测定法定量100R材料。
一式三份测试样品。让体积排阻色谱或SEC色谱柱平衡至室温。使用塔式装置背面的电源开关打开AFC，如有必要，请按主菜单触摸屏上的设置来调整称重传感器的设置。
在设置屏幕中，通过选择轮播，然后选择校准来对齐轮播。将转盘的 13 个小孔朝上插入 AFC 塔中，并通过按减号或加号按钮调整转盘，使流体喷嘴直接位于冲洗位置上方。从平衡的SEC色谱柱上取下盖子，然后将SEC色谱柱滑入相应的色谱柱安装座。
小心地将其安装在AFC塔上。确保色谱柱上的射频识别标签面向AFC，并检查色谱柱与阀门之间的连接是否牢固。将废物出口管放入收集容器中。
在设置屏幕中，选择收集计划，然后按减号或加号按钮将计数设置为 13，将大小设置为 0.5 毫升。将缓冲液体积设置保留为默认值 2.7 毫升，然后关闭收集计划窗口。从主屏幕中选择“开始收集”，然后选择“是”来确认收集参数。
装入13个标记的1.7毫升微量离心管，盖子打开并指向转盘中心。通过选择“确定”推进AFC，然后安装色谱柱储液罐，然后按“确定”再次前进。按“是”（Yes）选择刷新色谱柱的选项，并添加一个0.2微米过滤PBS色谱柱体积以去除任何存储缓冲液。刷新完成后，按 OK 推进 AFC。将传送带盖放在 AFC 上，然后按 OK。使用移液器从色谱柱中去除多余的缓冲液。
用1X PBS将3毫克100R样品带到500微升，并将样品添加到色谱柱顶部。制备一列体积的0.2微米过滤PBS。推进AFC并允许样品进入品格。
样品完全进入色谱柱后，将先前制备的PBS添加到储液槽中。监控AFC的运行，同时它首先收集空隙体积，然后收集指定的分数。运行完成并且转盘返回到废物位置后，从转盘中取下盖子和馏分管。
对于从 3 毫克 100R Mtb CFP 中收集的 0.5 毫米级分，使用微 BCA 以 1：3 稀释度测量蛋白质浓度，每个样品编号为 1 至 7 的馏分一式三份。对于编号为 5 至 13 的 0.5 毫升馏分，使用不稀释的 BCA 对每个样品一式三份。将SDS样品缓冲液添加到每个级分的10微升和5微克的CFP和100R中。
在100摄氏度下煮五分钟。然后用分子量阶梯上样4至12%Bis-Tris凝胶，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳或PAGE。使用 1X MES 电泳缓冲液和 200 伏电流运行 SDS-PAGE 凝胶 35 分钟。
从凝胶盒中取出凝胶，并施加50伏电流至少一小时，将分离的蛋白质转移到0.2微米硝酸纤维素膜上。最后，进行蛋白质印迹分析以评估蛋白质。用银染色的SDS-PAGE凝胶显示了每个级分的总体蛋白质谱。
数据显示，后面的馏分含有更多的蛋白质，类似于100R材料。检测LAM、LpqH和GroES的蛋白质印迹表明，蛋白质标志物在馏分中发生了变化。此处显示了固定前拉动的SEC级分1至3的透射电子显微镜或TEM图像。
对Mtb EV的密度梯度超速离心进行负染色以进行TEM成像。此处显示了SEC级分1至3的纳米颗粒跟踪分析或NTA分布。采用纳米颗粒跟踪分析对密度梯度超速离心Mtb EVs进行了分析，并显示了尺寸分布。
该协议已针对 3 毫克 100R 的 EV 纯化进行了优化。如果蛋白质上样量变化，则可能需要调整所得馏分的推荐稀释度和BCA策略。用这种技术制备的Mtb EV可用于下游成分和基于组学的研究。
它们也适用于体外和体内实验。该技术为生产高质量的Mtb EV制剂提供了一种简单有效的方法，为未来Mtb EV实验的可重复性铺平了道路。
