Ce protocole réduit la complexité technique et le temps nécessaire à l’enrichissement des vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Il offre une alternative douce aux techniques traditionnelles d’ultracentrifugation et de densité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser, ce qui la rend plus reproductible.
Il fournit un rendement élevé de VE Mtb avec un co-enrichissement minimal des protéines non-EV. La démonstration de la procédure sera assurée par Joanie Ryan, une ancienne étudiante diplômée de notre laboratoire. Pour commencer, préparez un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons en ajoutant la pleine capacité volumique du PBS.
Centrifuger pendant cinq minutes à 2 800 fois G à 4 degrés Celsius. Jetez le PBS restant et remplissez la chambre d’échantillonnage avec du Mtb CFP jusqu’à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 fois G à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimum du dispositif d’ultrafiltration.
Répéter si nécessaire jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit. Ajoutez 1X PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit précédemment et répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage complet et un échange tampon.
Ensuite, récupérez le rétentat concentré de CFP de 100 kilodaltons ou 100R, selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration. Lavez le filtre avec un volume minimal de 1X PBS au moins trois fois et tirez le lavage avec le 100R pour maximiser la récupération. Utiliser plusieurs échantillons de dilution dans du PBS et quantifier le matériau 100R avec un dosage bicinchoninique.
Testez l’échantillon en trois exemplaires. Laisser la chromatographie d’exclusion de taille, ou colonne SEC, s’équilibrer à température ambiante. Allumez l’AFC à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de la tour et appuyez sur Configuration sur l’écran tactile du menu principal si nécessaire pour ajuster les paramètres de la cellule de charge.
Dans l’écran de configuration, alignez le carrousel en sélectionnant Carrousel puis Calibrer. Insérez le carrousel avec les 13 petits trous vers le haut dans la tour AFC et ajustez le carrousel en appuyant sur les boutons moins ou plus de sorte que la buse de fluide soit directement au-dessus de la position de chasse d’eau. Retirez les capuchons de la colonne SEC équilibrée et faites glisser la colonne SEC dans le support de colonne approprié.
Installez-le soigneusement sur la tour AFC. Assurez-vous que l’étiquette d’identification par radiofréquence sur la colonne fait face à l’AFC et vérifiez que la connexion entre la colonne et la vanne est sécurisée. Placez le tuyau de sortie des déchets dans un récipient de collecte.
Dans l’écran de configuration, sélectionnez Calendrier de collecte et réglez le nombre sur 13 et la taille sur 0,5 millilitre en appuyant sur les boutons moins ou plus. Conservez le paramètre de volume de mémoire tampon par défaut de 2,7 millilitres, puis fermez la fenêtre de planification de collecte. Sélectionnez Démarrer la collecte dans l’écran d’accueil et confirmez les paramètres de collecte en sélectionnant Oui.
Chargez 13 tubes microcentrifugeuses étiquetés de 1,7 millilitre avec les couvercles ouverts et pointant vers le centre du carrousel. Avancez l’AFC en sélectionnant OK, puis montez le réservoir de colonne et avancez à nouveau en appuyant sur OK. Sélectionnez l’option permettant de vider la colonne en appuyant sur Oui et ajoutez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 micromètre pour supprimer tout tampon de stockage. Une fois le rinçage terminé, avancez l’AFC en appuyant sur OK. Placez le couvercle du carrousel sur l’AFC et appuyez sur OK. Utilisez une pipette pour éliminer tout excès de tampon de la colonne.
Apportez trois milligrammes d’échantillon 100R à 500 microlitres avec 1X PBS et ajoutez l’échantillon en haut de la colonne. Préparez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 micromètre. Avancez l’AFC et laissez l’échantillon s’écouler dans la frette.
Une fois que l’échantillon est complètement entré dans la colonne, ajouter le PBS préparé précédemment dans le réservoir. Surveillez l’exécution de l’AFC pendant qu’il collecte d’abord le volume vide, puis les fractions spécifiées. Une fois l’exécution terminée et le carrousel remis en position de déchets, retirez le couvercle et les tubes de fraction du carrousel.
Pour les fractions de 0,5 millimètre prélevées à partir de trois milligrammes de CFP 100R Mtb, mesurer la concentration en protéines à l’aide du micro-BCA avec une dilution de 1:3 pour les fractions numérotées de 1 à 7 de chaque échantillon en trois exemplaires. Pour les fractions de 0,5 millilitre numérotées de 5 à 13, utiliser le BCA sans dilution pour chaque échantillon en trois exemplaires. Ajouter un tampon d’échantillon SDS à 10 microlitres de chaque fraction et cinq microgrammes de CFP et 100R.
Faire bouillir pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius. Chargez ensuite sur un gel Bis-Tris à 4 à 12% avec une échelle de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, ou PAGE. Exécutez un gel SDS-PAGE en utilisant un tampon de fonctionnement MES 1X et un courant de 200 volts pendant 35 minutes.
Retirez le gel de la cassette et appliquez un courant de 50 volts pendant au moins une heure pour transférer les protéines résolues sur une membrane de nitrocellulose de 0,2 micromètre. Enfin, effectuez l’analyse par transfert Western pour évaluer les protéines. Un gel SDS-PAGE coloré à l’argent démontre le profil protéique global de chaque fraction.
Les données montrent que les fractions ultérieures contiennent plus de protéines et ressemblent au matériau 100R. Les transferts Western détectant LAM, LpqH et GroES démontrent que les marqueurs protéiques changent d’une fraction à l’autre. La microscopie électronique à transmission, ou images MET, des fractions SEC 1 à 3 tirées avant la fixation est montrée ici.
L’ultracentrifugation à gradient de densité des véhicules électriques à vtt a été négativement colorée pour l’imagerie TEM. L’analyse de suivi des nanoparticules, ou distribution NTA, des fractions SEC 1 à 3 est illustrée ici. Les EV Mtb à ultracentrifugation à gradient de densité ont été analysés avec une analyse de suivi des nanoparticules, et la distribution de taille est affichée ici.
Ce protocole a été optimisé pour la purification EV à partir de trois milligrammes de 100R. Si la charge protéique est variable, la dilution recommandée et la stratégie de BCA sur les fractions résultantes peuvent nécessiter un ajustement. Les VE MTB préparés avec cette technique peuvent être utilisés pour des études de composition en aval et des études omiques.
Ils conviennent également aux expériences in vitro et in vivo. Cette technique fournit un moyen facile et efficace de produire des préparations de VTT EV de haute qualité, ouvrant la voie à une reproductibilité accrue dans les futures expériences de Mtb EV.
