Este protocolo reduce la complejidad técnica y el tiempo requerido para el enriquecimiento de vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Proporciona una alternativa suave a la ultracentrifugación tradicional y las técnicas basadas en la densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, por lo que es más reproducible.
Proporciona un alto rendimiento de Mtb EVs con un mínimo co-enriquecimiento de proteínas no EV. Demostrando el procedimiento estará Joanie Ryan, una ex estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton agregando la capacidad de volumen total de PBS.
Centrifugar durante cinco minutos a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados. Deseche el flujo continuo y cualquier PBS restante, y llene la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración.
Repita según sea necesario hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente. Agregue 1X PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describió anteriormente y repita este paso cinco veces para garantizar el lavado completo y el intercambio de tampón.
Luego, recupere el retentado CFP concentrado de 100 kilodalton o 100R, de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración. Lave el filtro con un volumen mínimo de 1X PBS al menos tres veces, y tire del lavado con el 100R para maximizar la recuperación. Utilice varias diluciones de muestras en PBS y cuantifique el material 100R con un ensayo bicinchonínico.
Pruebe la muestra por triplicado. Permita que la cromatografía de exclusión de tamaño, o columna SEC, se equilibre a temperatura ambiente. Encienda el AFC con el interruptor de encendido situado en la parte posterior de la unidad de torre y pulse Setup (Configuración) en la pantalla táctil del menú principal si es necesario para ajustar los ajustes de la célula de carga.
En la pantalla de configuración, alinee el carrusel seleccionando Carrusel seguido de Calibrar. Inserte el carrusel con los 13 orificios pequeños hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel presionando los botones menos o más para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga. Retire las tapas de la columna SEC equilibrada y deslice la columna SEC en el soporte de columna adecuado.
Instálelo cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recolección.
En la pantalla de configuración, seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 mililitros presionando los botones menos o más. Deje la configuración de volumen de búfer como predeterminada de 2,7 mililitros y, a continuación, cierre la ventana de programación de recogida. Seleccione Iniciar recopilación en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de recopilación seleccionando Sí.
Load 13 etiquetado como tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel. Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando Sí y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK. Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.
Lleve tres miligramos de muestra 100R a 500 microlitros con 1X PBS y agregue la muestra a la parte superior de la columna. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros. Avance el AFC y permita que la muestra se ejecute en el traste.
Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado anteriormente al depósito. Supervise la ejecución del AFC mientras recopila primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Después de que se complete la ejecución y el carrusel vuelva a la posición de desecho, retire la cubierta y los tubos de fracción del carrusel.
Para fracciones de 0,5 milímetros recogidas de tres miligramos de 100R Mtb CFP, medir la concentración de proteína utilizando el micro-BCA con una dilución 1:3 para fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado. Para fracciones de 0,5 mililitros numeradas del 5 al 13, use el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado. Agregue el tampón de muestra SDS a 10 microlitros de cada fracción y cinco microgramos de CFP y 100R.
Hervir durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Luego cargue en un gel de 4 a 12% de Bis-Tris con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida, o PAGE. Ejecute un gel SDS-PAGE utilizando un búfer de funcionamiento MES 1X y una corriente de 200 voltios durante 35 minutos.
Retire el gel del casete y aplique una corriente de 50 voltios durante un mínimo de una hora para transferir las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 micrómetros. Finalmente, realice el análisis de Western blot para evaluar las proteínas. Un gel SDS-PAGE teñido con plata demuestra el perfil proteico general para cada fracción.
Los datos muestran que las fracciones posteriores contienen más proteínas y se asemejan al material 100R. Los Western blots que detectan LAM, LpqH y GroES demuestran que el marcador de proteínas cambia a través de las fracciones. Aquí se muestra la microscopía electrónica de transmisión, o imágenes TEM, de las fracciones SEC 1 a 3 extraídas antes de la fijación.
La ultracentrifugación por gradiente de densidad de los EV Mtb se tiñó negativamente para las imágenes TEM. El análisis de seguimiento de nanopartículas, o distribución NTA, de las fracciones SEC 1 a 3 se muestra aquí. Los EV de ultracentrifugación de gradiente de densidad Mtb se analizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, y la distribución de tamaño se muestra aquí.
Este protocolo ha sido optimizado para la purificación de EV a partir de tres miligramos de 100R. Si la carga proteica es variada, la dilución recomendada y la estrategia de BCA en las fracciones resultantes pueden requerir ajustes. Los EV de MTB preparados con esta técnica se pueden utilizar para estudios posteriores basados en la composición y ómicas.
También son adecuados para experimentos in vitro e in vivo. Esta técnica proporciona una forma fácil y eficiente de producir preparaciones de Mtb EV de alta calidad, allanando el camino para una mayor reproducibilidad en futuros experimentos de Mtb EV.
