このプロトコルは、結核菌、Mtb EVからの細胞外小胞の濃縮に必要な技術的な複雑さと時間を削減します。従来の超遠心分離や密度ベースの技術に代わる穏やかな方法を提供します。この手法の主な利点は、実行が簡単で、再現性が高いことです。
最小限の非EVタンパク質共濃縮で高収率のMtb EVを提供します。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の元大学院生であるジョアニーライアンです。まず、PBSの全容量を追加して、分子量100キロダルトンのカットオフ遠心フィルターを準備します。
摂氏4度で2, 800倍Gで5分間遠心分離する。フロースルーと残りのPBSを廃棄し、サンプルチャンバーにMtb CFPを最大容量まで充填します。容積が限外ろ過装置の最小容積まで減少するまで、摂氏4度で2, 800倍Gで遠心分離する。
サンプル全体が十分に減少するまで、必要に応じて繰り返します。濃縮物を含むフィルターユニットに1X PBSをデバイスの総容量まで追加します。前述のように容量を下げ、この手順を5回繰り返して、完全な洗浄とバッファー交換を確実にします。
次いで、限外ろ過装置の仕様に従って、100キロダルトンの濃縮CFP保持液または100Rを回収する。1X PBSの最小容量でフィルターを少なくとも3回洗浄し、100Rで洗浄液を引っ張って回復を最大化します。PBS中のサンプルを数回希釈し、ビシンコニンアッセイで100R材料を定量します。
サンプルを3連でテストします。サイズ排除クロマトグラフィー(SECカラム)を室温まで平衡化します。タワーユニットの背面にある電源スイッチを使用してAFCの電源を入れ、必要に応じてメインメニューのタッチスクリーンで[セットアップ]を押して、ロードセルの設定を調整します。
セットアップ画面で、カルーセルを選択してから[キャリブレーション]を選択して、カルーセルの位置を合わせます。13個の小さな穴を上に向けてカルーセルをAFCタワーに挿入し、マイナスボタンまたはプラスボタンを押してカルーセルを調整し、流体ノズルがフラッシュ位置の真上になるようにします。平衡化されたSECカラムからキャップを取り外し、SECカラムを適切なカラムマウントにスライドさせます。
AFCタワーに慎重に設置してください。カラムの高周波識別タグがAFCに面していることを確認し、カラムとバルブ間の接続がしっかりしていることを確認します。廃棄物出口チューブを収集容器に入れます。
セットアップ画面で[収集スケジュール]を選択し、マイナスボタンまたはプラスボタンを押して、カウントを13に、サイズを0.5ミリリットルに設定します。バッファー容量の設定をデフォルトの 2.7 ミリリットルのままにして、収集スケジュールウィンドウを閉じます。ホーム画面から[収集の開始]を選択し、[はい]を選択して収集パラメータを確認します。
蓋を開けてカルーセルの中心を向いた状態で、ラベルの付いた1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブを13本ロードします。[OK]を選択してAFCを進め、次にカラムリザーバーを取り付け、OKを押して再度進めます。[はい] を押してカラムをフラッシュするオプションを選択し、0.2 マイクロメートルのフィルター PBS のカラム容量を 1 つ追加して、ストレージ バッファーを削除します。フラッシュが完了したら、[OK]を押してAFCを進めます。カルーセルカバーをAFCの上に置き、[OK]を押します。ピペットを使用して、カラムから余分なバッファーを取り除きます。
1X PBSで3ミリグラムの100Rサンプルを500マイクロリットルに持ち込み、サンプルをカラムの上部に追加します。0.2マイクロメートルのろ過PBSの1カラム容量を準備します。AFCを進め、サンプルをフレットに流します。
サンプルがカラムに完全に入ったら、前に準備したPBSをリザーバーに追加します。AFCの実行を監視しながら、最初にボイドボリュームを収集し、次に指定されたフラクションを収集します。実行が完了し、カルーセルが廃棄物の位置に戻ったら、カバーとフラクションチューブをカルーセルから取り外します。
3ミリグラムの100R Mtb CFPから採取した0.5ミリメートルの画分について、各サンプルの1〜7の番号が付けられた画分を3:3に希釈したマイクロBCAを使用してタンパク質濃度を測定します。5〜13の番号が付けられた0.5ミリリットルの画分の場合、3連の各サンプルに希釈せずにBCAを使用します。SDSサンプルバッファーを各フラクション10マイクロリットルと5マイクログラムのCFPおよび100Rに加えます。
摂氏100度で5分間煮る。次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の分子量ラダーまたはPAGEを備えた4〜12%ビストリスゲルにロードします。1X MESランニングバッファーと200ボルトの電流を使用してSDS-PAGEゲルを35分間実行します。
カセットからゲルを取り出し、50ボルトの電流を最低1時間印加して、分解されたタンパク質を0.2マイクロメートルのニトロセルロースメンブレンに移します。最後に、ウェスタンブロット解析を行い、タンパク質を評価します。銀で染色されたSDS-PAGEゲルは、各画分の全体的なタンパク質プロファイルを示しています。
データは、後の画分がより多くのタンパク質を含み、100R材料に似ていることを示しています。LAM、LpqH、およびGroESを検出するウェスタンブロットは、タンパク質マーカーが画分間で変化することを示しています。固定前に引っ張られたSECフラクション1〜3の透過型電子顕微鏡またはTEM画像がここに示されています。
Mtb EVの密度勾配超遠心分離は、TEMイメージングのために陰性染色されました。SECフラクション1〜3のナノ粒子追跡分析(NTA分布)を以下に示します。密度勾配超遠心Mtb EVをナノ粒子追跡分析で分析し、サイズ分布をここに表示します。
このプロトコルは、3ミリグラムの100RからのEV精製用に最適化されています。タンパク質負荷が変動する場合、得られた画分に対する推奨される希釈およびBCA戦略の調整が必要になる場合があります。この技術で調製されたMtb EVは、下流の組成研究やオミクスベースの研究に使用できます。
また、インビトロおよびインビボ実験にも適しています。この技術は、高品質のMtb EV調製物を簡単かつ効率的に製造する方法を提供し、将来のMtb EV実験における再現性の向上への道を開きます。
