Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV'lerden hücre dışı veziküllerin zenginleştirilmesi için gereken teknik karmaşıklığı ve zamanı azaltır. Geleneksel ultrasantrifüjleme ve yoğunluğa dayalı tekniklere nazik bir alternatif sunar. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin kolay olması ve daha tekrarlanabilir hale getirilmesidir.
Minimum EV olmayan protein ortak zenginleştirme ile yüksek verim Mtb EV'ler sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızın eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Joanie Ryan olacak. Başlamak için, PBS'nin tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi hazırlayın.
2'de beş dakika santrifüj, 4 santigrat derecede 800 kez G. Akış akışını ve kalan PBS'yi atın ve numune haznesini maksimum kapasitesine kadar Mtb CFP ile doldurun. 2'de santrifüj, hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 santigrat derecede G'de 800 kez.
Tüm numune yeterince azaltılana kadar gerektiği kadar tekrarlayın. Toplam cihaz kapasitesine kadar konsantreyi içeren filtre ünitesine 1X PBS ekleyin. Ses seviyesini daha önce açıklandığı gibi azaltın ve tam yıkama ve tampon değişimi sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın.
Ardından, ultrafiltrasyon cihazı spesifikasyonlarına göre 100 kilodalton konsantre CFP retentat veya 100R'yi geri kazanın. Filtreyi en az üç kez minimum 1X PBS hacmiyle yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile çekin. PBS'de numunelerin birkaç seyreltilmesini kullanın ve 100R malzemeyi bikinkoninik bir tahlille sayısallaştırın.
Numuneyi üçlü olarak test edin. Boyut hariç tutma kromatografisinin veya SEC sütununun oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Kule ünitesinin arkasındaki güç düğmesini kullanarak AFC'yi açın ve yük hücresinin ayarlarını yapmak için gerekirse ana menü dokunmatik ekranındaki Kurulum düğmesine basın.
Kurulum ekranından, Döngü'yü ve ardından Kalibre Et'i seçerek döngüyü hizalayın. Atlıkarınca 13 küçük delik AFC kulesine bakacak şekilde yerleştirin ve eksi veya artı düğmelerine basarak döngüyü sıvı nozulu doğrudan gömme konumunun üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Dengelenmiş SEC sütunundan büyük harfleri çıkarın ve SEC sütununu uygun sütun montajına kaydırın.
AFC kulesine dikkatlice monte edin. Sütundaki radyo frekansı tanımlama etiketinin AFC'ye baktığından emin olun ve sütun ile valf arasındaki bağlantının sağlam olup olmadığını kontrol edin. Atık çıkış borusunu bir toplama kabına yerleştirin.
Kurulum ekranından Koleksiyon Programı'nı seçin ve eksi veya artı düğmelerine basarak sayıyı 13'e, boyutu ise 0,5 mililitreye ayarlayın. Arabellek hacmi ayarını varsayılan 2,7 mililitre olarak bırakın ve ardından toplama zamanlaması penceresini kapatın. Giriş ekranından Koleksiyonu Başlat'ı seçin ve Evet'i seçerek koleksiyon parametrelerini onaylayın.
13 etiketli 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerini, kapakları açık ve atlıkarınca merkezine doğru işaret edecek şekilde yükleyin. Tamam'ı seçerek AFC'yi ilerletin, ardından sütun rezervuarını takın ve Tamam düğmesine basarak tekrar ilerleyin. Evet tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin ve depolama arabelleğini kaldırmak için 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi ekleyin. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, Tamam düğmesine basarak AFC'yi ilerletin. Dönen kapağı AFC'nin üzerine yerleştirin ve Tamam'a basın. Sütundaki fazla tamponu çıkarmak için pipet kullanın.
1X PBS ile 500 mikrolitreye üç miligram 100R numune getirin ve numuneyi sütunun üstüne ekleyin. 0,2 mikrometre filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi hazırlayın. AFC'yi ilerletin ve numunenin perdeye girmesine izin verin.
Örnek sütuna tamamen girdikten sonra, daha önce hazırlanan PBS'yi rezervuara ekleyin. AFC'nin çalışmasını izlerken önce boşluk hacmini ve ardından belirtilen kesirleri toplar. Çalıştırma tamamlandıktan ve atlıkarınca atık konumuna döndükten sonra, kapağı ve fraksiyon tüplerini atlıkarınca bölümünden çıkarın.
Üç miligram 100R Mtb CFP'den toplanan 0,5 milimetre fraksiyonlar için, mikro-BCA'yı kullanarak protein konsantrasyonunu, her numunenin 1 ila 7'sini üçlü olarak numaralandırılan fraksiyonlar için 1: 3 seyreltme ile ölçün. 5 ila 13 arasında numaralandırılmış 0,5 mililitre fraksiyonlar için, üçlü olarak her numune için seyreltme olmadan BCA'yı kullanın. SDS numune tamponunu her fraksiyonun 10 mikrolitresine ve beş mikrogram CFP ve 100R'ye ekleyin.
100 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Daha sonra poliakrilamid jel elektroforezi veya PAGE için moleküler ağırlıklı bir merdiven ile% 4 ila% 12'lik bir Bis-Tris jeli üzerine yükleyin. 1X MES çalışma arabelleği ve 200 voltluk akım kullanarak bir SDS-PAGE jelini 35 dakika boyunca çalıştırın.
Jeli kasetten çıkarın ve çözünmüş proteinleri 0.2 mikrometre nitroselüloz membrana aktarmak için en az bir saat boyunca 50 voltluk bir akım uygulayın. Son olarak, proteinleri değerlendirmek için Batı leke analizini yapın. Gümüş ile boyanmış bir SDS-PAGE jel, her fraksiyon için genel protein profilini gösterir.
Veriler, daha sonraki fraksiyonların daha fazla protein içerdiğini ve 100R malzemesine benzediğini göstermektedir. LAM, LpqH ve GroES'i tespit eden batı lekeleri, protein belirtecinin fraksiyonlar arasında değiştiğini göstermektedir. Fiksasyondan önce çekilen 1 ila 3 arasındaki SEC fraksiyonlarının transmisyon elektron mikroskobu veya TEM görüntüleri burada gösterilmiştir.
Mtb EV'lerin yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlenmesi TEM görüntüleme için negatif boyandı. SEC fraksiyonları 1 ila 3'ün nanopartikül izleme analizi veya NTA dağılımı burada gösterilmiştir. Yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme Mtb EV'leri nanopartikül izleme analizi ile analiz edildi ve boyut dağılımı burada görüntülendi.
Bu protokol, üç miligram 100R'den EV saflaştırması için optimize edilmiştir. Protein yükü değişirse, ortaya çıkan fraksiyonlar üzerinde önerilen seyreltme ve BCA stratejisi ayarlama gerektirebilir. Bu teknikle hazırlanan Mtb EV'ler, aşağı akış kompozisyonel ve omik tabanlı çalışmalar için kullanılabilir.
Ayrıca in vitro ve in vivo deneyler için de uygundurlar. Bu teknik, yüksek kaliteli Mtb EV preparatları üretmek için kolay ve verimli bir yol sağlar ve gelecekteki Mtb EV deneylerinde daha fazla tekrarlanabilirliğin önünü açar.
