Dieses Protokoll reduziert die technische Komplexität und den Zeitaufwand für die Anreicherung extrazellulärer Vesikel aus Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Es bietet eine sanfte Alternative zu herkömmlichen Ultrazentrifugations- und dichtebasierten Techniken. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach durchzuführen ist, wodurch sie reproduzierbarer wird.
Es bietet eine hohe Ausbeute an Mtb-EVs mit minimaler Nicht-EV-Protein-Co-Anreicherung. Joanie Ryan, eine ehemalige Doktorandin unseres Labors, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, bereiten Sie einen 100-Kilodaltonnen-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalfilter vor, indem Sie die volle Volumenkapazität von PBS hinzufügen.
Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 2.800 mal G bei 4 Grad Celsius. Verwerfen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS und füllen Sie die Probenkammer mit Mtb CFP bis zu ihrer maximalen Kapazität. Zentrifugieren Sie bei 2.800 mal G bei 4 Grad Celsius, bis das Volumen auf das Mindestvolumen der Ultrafiltrationsvorrichtung reduziert ist.
Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde. Fügen Sie der Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, 1X PBS bis zur Gesamtgerätekapazität hinzu. Reduzieren Sie das Volumen wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Wäsche und einen Pufferaustausch zu gewährleisten.
Gewinnen Sie dann das 100-Kilodalton-konzentrierte CFP-Retentat oder 100R gemäß den Spezifikationen der Ultrafiltrationsvorrichtung. Waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem minimalen Volumen von 1X PBS und ziehen Sie die Wäsche mit dem 100R, um die Rückgewinnung zu maximieren. Verwenden Sie mehrere Verdünnungen von Proben in PBS und quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay.
Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung. Lassen Sie die Größenausschlusschromatographie oder SEC-Spalte an die Raumtemperatur angleichen. Schalten Sie den AFC über den Netzschalter auf der Rückseite der Tower-Einheit ein und drücken Sie bei Bedarf auf dem Touchscreen des Hauptmenüs auf Setup, um die Einstellungen für die Wägezelle anzupassen.
Richten Sie das Karussell auf dem Setup-Bildschirm aus, indem Sie Karussell und anschließend Kalibrieren auswählen. Stecken Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm und stellen Sie das Karussell durch Drücken der Minus- oder Plus-Tasten so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der Spülposition befindet. Entfernen Sie die Kappen aus der ausgeglichenen SEC-Säule, und schieben Sie die SEC-Spalte in die entsprechende Säulenhalterung.
Installieren Sie es vorsichtig auf dem AFC-Turm. Stellen Sie sicher, dass das Funkfrequenz-Identifikationsetikett an der Säule dem AFC zugewandt ist, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Abfallauslassschlauch in einen Auffangbehälter.
Wählen Sie im Setup-Bildschirm Sammlungszeitplan und stellen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 Milliliter ein, indem Sie die Minus- oder Plus-Tasten drücken. Behalten Sie die Einstellung für das Puffervolumen als Standardeinstellung von 2,7 Milliliter bei, und schließen Sie dann das Fenster mit dem Erfassungszeitplan. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Sammlung starten aus, und bestätigen Sie die Sammlungsparameter, indem Sie Ja auswählen.
Laden Sie 13 beschriftete 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffnetem Deckel und zeigen Sie in Richtung Karussellmitte. Verschieben Sie den AFC, indem Sie OK auswählen, montieren Sie dann den Säulenbehälter und fahren Sie wieder fort, indem Sie OK drücken. Wählen Sie die Option zum Leeren der Säule aus, indem Sie Ja drücken, und fügen Sie ein Spaltenvolumen mit 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS hinzu, um den Speicherpuffer zu entfernen. Sobald der Flush abgeschlossen ist, schieben Sie den AFC voran, indem Sie OK drücken. Legen Sie die Karussellabdeckung über den AFC und drücken Sie OK. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer aus der Säule zu entfernen.
Bringen Sie drei Milligramm 100R-Probe mit 1X PBS auf 500 Mikroliter und fügen Sie die Probe oben in die Spalte ein. Bereiten Sie ein Säulenvolumen von 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS vor. Schieben Sie den AFC vor, und lassen Sie die Probe in den Bund laufen.
Sobald die Probe vollständig in die Säule gelangt ist, fügen Sie das zuvor vorbereitete PBS in das Reservoir ein. Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Hohlraumvolumen und dann die angegebenen Brüche sammelt. Nachdem der Lauf beendet ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und die Fraktionsröhrchen aus dem Karussell.
Für 0,5-Millimeter-Fraktionen, die aus drei Milligramm 100R Mtb CFP gesammelt wurden, messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Mikro-BCA mit einer 1:3-Verdünnung für Fraktionen mit den Nummern 1 bis 7 jeder Probe in dreifacher Ausfertigung. Für 0,5-Milliliter-Fraktionen mit den Nummern 5 bis 13 verwenden Sie den BCA ohne Verdünnung für jede Probe in dreifacher Ausfertigung. Fügen Sie SDS-Probenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Fraktion und fünf Mikrogramm CFP und 100R hinzu.
Fünf Minuten bei 100 Grad Celsius kochen. Laden Sie dann ein 4 bis 12% Bis-Tris-Gel mit einer Molekulargewichtsleiter für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder PAGE auf. Lassen Sie ein SDS-PAGE Gel mit 1X MES Laufpuffer und einem 200-Volt-Strom für 35 Minuten laufen.
Entfernen Sie das Gel von der Kassette und wenden Sie mindestens eine Stunde lang einen 50-Volt-Strom an, um die aufgelösten Proteine auf eine 0,2-Mikrometer-Nitrozellulosemembran zu übertragen. Führen Sie schließlich die Western-Blot-Analyse durch, um die Proteine zu bewerten. Ein mit Silber gefärbtes SDS-PAGE Gel zeigt das Gesamtproteinprofil für jede Fraktion.
Die Daten zeigen, dass die späteren Fraktionen mehr Protein enthalten und dem 100R-Material ähneln. Western Blots zum Nachweis von LAM, LpqH und GroES zeigen, dass sich der Proteinmarker über die Fraktionen hinweg ändert. Transmissionselektronenmikroskopie oder TEM-Bilder von SEC-Fraktionen 1 bis 3, die vor der Fixierung gezogen wurden, sind hier gezeigt.
Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von Mtb-EVs wurde für die TEM-Bildgebung negativ angefärbt. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse oder NTA-Verteilung der SEC-Fraktionen 1 bis 3 ist hier dargestellt. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugations-Mtb-EVs wurden mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse analysiert, und die Größenverteilung wird hier angezeigt.
Dieses Protokoll wurde für die EV-Reinigung von drei Milligramm 100R optimiert. Wenn die Proteinbelastung variiert wird, müssen die empfohlene Verdünnungs- und BCA-Strategie für die resultierenden Fraktionen möglicherweise angepasst werden. Mit dieser Technik hergestellte MTB-EVs können für nachgeschaltete Zusammensetzungs- und Omics-basierte Studien verwendet werden.
Sie eignen sich auch für in vitro und in vivo Experimente. Diese Technik bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, qualitativ hochwertige Mtb-EV-Präparate herzustellen und ebnet den Weg für eine erhöhte Reproduzierbarkeit in zukünftigen Mtb-EV-Experimenten.
