이 프로토콜은 결핵균, Mtb EV에서 세포 외 소포를 농축하는 데 필요한 기술적 복잡성과 시간을 줄입니다. 전통적인 초원심분리 및 밀도 기반 기술에 대한 부드러운 대안을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 수행하기 쉽고 재현성이 높다는 것입니다.
최소한의 비 EV 단백질 공동 농축으로 높은 수율의 Mtb EV를 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 전 대학원생 인 Joanie Ryan이 될 것입니다. 시작하려면 PBS의 전체 부피 용량을 추가하여 100킬로달톤 분자량 차단 원심 필터를 준비합니다.
섭씨 4도에서 2, 800 배 G에서 5 분간 원심 분리합니다. 플로우스루 및 나머지 PBS를 폐기하고 샘플 챔버를 최대 용량까지 Mtb CFP로 채웁니다. 부피가 한외 여과 장치의 최소 부피로 감소 할 때까지 섭씨 4도에서 2, 800 배 G에서 원심 분리합니다.
전체 샘플이 충분히 줄어들 때까지 필요에 따라 반복합니다. 농축물을 포함하는 필터 장치에 1X PBS를 총 장치 용량까지 추가합니다. 앞에서 설명한 대로 부피를 줄이고 이 단계를 5회 반복하여 세척 및 완충액 교환이 완료되도록 합니다.
이어서, 한외여과 장치 규격에 따라 100-킬로달톤 농축된 CFP 잔류물 또는 100R을 회수한다. 최소 부피의 1X PBS로 필터를 최소 3회 세척하고 100R로 세척을 당겨 회수율을 최대화합니다. PBS에서 여러 희석된 샘플을 사용하고 이분법으로 100R 물질을 정량합니다.
샘플을 삼중으로 테스트합니다. 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼이 실온과 평형을 이루도록 합니다. 타워 장치 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 AFC를 켜고 필요한 경우 메인 메뉴 터치 스크린에서 설정을 눌러 로드셀 설정을 조정합니다.
설정 화면에서 캐러셀을 선택한 다음 보정을 선택하여 캐러셀을 정렬합니다. 13개의 작은 구멍이 위를 향하도록 캐러셀을 AFC 타워에 삽입하고 유체 노즐이 플러시 위치 바로 위에 오도록 마이너스 또는 플러스 버튼을 눌러 캐러셀을 조정합니다. 평형화된 SEC 컬럼에서 캡을 제거하고 SEC 컬럼을 적절한 컬럼 마운트에 밀어 넣습니다.
AFC 타워에 조심스럽게 설치하십시오. 컬럼의 무선 주파수 식별 태그가 AFC를 향하고 컬럼과 밸브 사이의 연결이 고정되어 있는지 확인하십시오. 폐기물 배출 튜브를 수거 용기에 넣으십시오.
설정 화면에서 수집 일정을 선택하고 빼기 또는 더하기 버튼을 눌러 개수를 13으로 설정하고 크기를 0.5밀리리터로 설정합니다. 버퍼 볼륨 설정을 기본값인 2.7밀리리터로 두고 수집 일정 창을 닫습니다. 홈 화면에서 수집 시작을 선택하고 Yes(예)를 선택하여 수집 매개 변수를 확인합니다.
뚜껑이 열려 있고 캐러셀 중앙을 가리키도록 라벨이 부착된 1.7ml의 1.7ml급 마이크로 원심분리기 튜브 13개를 로드합니다. OK를 선택하여 AFC를 진행한 다음 컬럼 저장소를 장착하고 OK를 눌러 다시 전진합니다. 예를 눌러 컬럼을 플러시하는 옵션을 선택하고 0.2마이크로미터 필터링된 PBS의 컬럼 부피 하나를 추가하여 스토리지 버퍼를 제거합니다. 플러시가 완료되면 OK를 눌러 AFC를 진행합니다. 캐러셀 커버를 AFC 위에 놓고 OK를 누릅니다. 피펫을 사용하여 컬럼에서 과도한 버퍼를 제거합니다.
100R 샘플 3mg을 1X PBS로 500마이크로리터로 가져오고 샘플을 컬럼 상단에 추가합니다. 0.2 마이크로미터 여과된 PBS의 컬럼 부피 하나를 준비한다. AFC를 진행하고 샘플이 프렛에 부딪히도록 합니다.
샘플이 컬럼에 완전히 들어가면 이전에 준비한 PBS를 저장소에 추가합니다. AFC가 먼저 보이드 볼륨을 수집한 다음 지정된 분수를 수집하는 동안 AFC의 실행을 모니터링합니다. 실행이 완료되고 캐러셀이 폐기물 위치로 돌아가면 캐러셀에서 덮개와 분수 튜브를 제거합니다.
100R Mtb CFP 3 밀리그램에서 수집 한 0.5 밀리미터 분획의 경우, 각 샘플의 1 내지 7 번 분획에 대해 1 : 3 희석 된 micro-BCA를 사용하여 단백질 농도를 삼중으로 측정합니다. 5에서 13까지 번호가 매겨진 0.5 밀리리터 분획의 경우 각 샘플에 대해 희석하지 않은 BCA를 삼중으로 사용하십시오. SDS 샘플 버퍼를 각 분획의 10 마이크로리터와 5 마이크로그램의 CFP 및 100R에 첨가한다.
섭씨 100도에서 5 분간 끓입니다. 그런 다음 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 PAGE를 위한 분자량 사다리가 있는 4-12%Bis-Tris 겔에 로드합니다. 1X MES 실행 버퍼와 200V 전류를 사용하여 SDS-PAGE 젤을 35분 동안 실행합니다.
카세트에서 젤을 제거하고 최소 1 시간 동안 50 볼트 전류를 적용하여 분해 된 단백질을 0.2 마이크로 미터 니트로 셀룰로오스 막으로 옮깁니다. 마지막으로, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 단백질을 평가한다. 은으로 염색된 SDS-PAGE 겔은 각 분획에 대한 전체 단백질 프로파일을 보여줍니다.
데이터는 나중 분획이 더 많은 단백질을 함유하고 100R 물질과 유사하다는 것을 보여줍니다. LAM, LpqH 및 GroES를 검출하는 웨스턴 블롯은 단백질 마커가 분획에 걸쳐 변화한다는 것을 입증합니다. 고정 전에 뽑은 SEC 분획 1 내지 3의 투과 전자 현미경 또는 TEM 이미지가 여기에 도시되어 있다.
Mtb EV의 밀도 구배 초원심분리는 TEM 이미징을 위해 음성으로 염색되었습니다. SEC 분획 1 내지 3의 나노입자 추적 분석 또는 NTA 분포가 여기에 나와 있다. 밀도 구배 초원심분리 Mtb EV는 나노입자 추적 분석으로 분석되었으며 크기 분포가 여기에 표시됩니다.
이 프로토콜은 3mg의 100R에서 EV 정제에 최적화되었습니다. 단백질 부하가 변하는 경우, 결과 분획에 대한 권장 희석 및 BCA 전략에 조정이 필요할 수 있습니다. 이 기술로 준비된 Mtb EV는 다운스트림 구성 및 오믹스 기반 연구에 사용할 수 있습니다.
또한 시험관 내 및 생체 내 실험에도 적합합니다. 이 기술은 고품질 Mtb EV 준비를 생산하는 쉽고 효율적인 방법을 제공하여 향후 Mtb EV 실험에서 재현성을 높일 수 있는 길을 열어줍니다.
