Этот протокол снижает техническую сложность и время, необходимое для обогащения внеклеточных везикул из Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV. Он обеспечивает мягкую альтернативу традиционным методам ультрацентрифугирования и плотности. Основным преимуществом данной методики является то, что ее легко выполнить, что делает ее более воспроизводимой.
Он обеспечивает высокий выход Mtb EV с минимальным сообогащением белка без EV. Продемонстрировать процедуру будет Джоани Райан, бывшая аспирантка нашей лаборатории. Для начала подготовьте 100-килодальтонный центробежный фильтр с молекулярной массой, добавив полную объемную емкость PBS.
Центрифуга в течение пяти минут при 2, 800 раз G при 4 градусах Цельсия. Отбросьте проточное прохождение и все оставшиеся PBS и заполните камеру отбора проб Mtb CFP до максимальной емкости. Центрифуга в 2 800 раз G при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства.
Повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока весь образец не будет достаточно уменьшен. Добавьте 1X PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите объем, как описано выше, и повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и буферную замену.
Затем извлеките 100-килодальтонный концентрированный кретентат CFP или 100R в соответствии со спецификациями ультрафильтрационного устройства. Промывайте фильтр с минимальным объемом 1X PBS не менее трех раз и потяните мойку с помощью 100R, чтобы максимизировать восстановление. Используйте несколько разбавлений образцов в PBS и количественно оцените материал 100R с помощью бицинхонинового анализа.
Протестируйте образец в трех экземплярах. Позвольте хроматографии исключения размера, или столбцу SEC, уравновеситься до комнатной температуры. Включите AFC с помощью выключателя питания на задней панели башенного блока и нажмите Setup на сенсорном экране главного меню, если это необходимо, чтобы настроить параметры для тензодатчика.
На экране настройки выровняйте карусель, выбрав «Кольцевая галерея», а затем «Калибровка». Вставьте карусель с 13 небольшими отверстиями, обращенными вверх, в башню AFC и отрегулируйте карусель, нажав кнопки «минус» или «плюс» так, чтобы сопло жидкости находилось непосредственно над положением заподлицо. Снимите колпачки с уравновешенного столбца SEC и переместите столбец SEC в соответствующее крепление столбца.
Аккуратно установите его на башню AFC. Убедитесь, что метка радиочастотной идентификации на колонне обращена к AFC, и убедитесь, что соединение между колонкой и клапаном надежно. Поместите выпускную трубку для отходов в контейнер для сбора.
На экране настройки выберите Расписание сбора и установите число 13, а размер 0,5 миллилитра, нажав кнопки минус или плюс. Оставьте значение громкости буфера равным по умолчанию 2,7 миллилитра и закройте окно расписания сбора. Выберите Запустить коллекцию на начальном экране и подтвердите параметры коллекции, нажав кнопку Да.
Груз 13 маркированных 1,7-миллилитровых микроцентрифужных трубок с открытыми крышками и направленными в сторону центра карусели. Переместите AFC, выбрав OK, затем смонтируйте резервуар колонны и снова нажмите OK. Выберите параметр для очистки столбца, нажав кнопку Да, и добавьте один столбец с фильтром PBS 0,2 микрометра, чтобы удалить любой буфер хранения. Как только промывка будет завершена, переместите AFC, нажав OK. Поместите крышку карусели на AFC и нажмите OK. Используйте пипетку, чтобы удалить лишний буфер из столбца.
Доведите три миллиграмма образца 100R до 500 микролитров с 1X PBS и добавьте образец в верхнюю часть столбца. Подготовьте один столбец объемом 0,2 микрометра с фильтром PBS. Раздвиньте AFC и позвольте образцу врезаться в лад.
После того, как образец полностью вошел в колонну, добавьте pBS, подготовленный ранее, в резервуар. Следите за выполнением AFC, пока он собирает сначала объем пустоты, а затем указанные фракции. После того, как пробег завершится и карусель вернется в исходное положение, снимите крышку и дробные трубки с карусели.
Для фракций размером 0,5 миллиметра, собранных из трех миллиграммов 100R Mtb CFP, измерьте концентрацию белка с использованием микро-BCA с разведением 1:3 для фракций, пронумерованных от 1 до 7 каждого образца в трех экземплярах. Для фракций 0,5 миллилитра, пронумерованных от 5 до 13, используйте BCA без разбавления для каждого образца в трех экземплярах. Добавьте буфер образцов SDS к 10 микролитрам каждой фракции и пяти микрограммам CFP и 100R.
Кипятить в течение пяти минут при 100 градусах Цельсия. Затем нагрузите гель от 4 до 12% Bis-Tris с лестницей молекулярной массы для электрофореза полиакриламидного геля или PAGE. Запустите гель SDS-PAGE, используя 1X MES рабочий буфер и ток 200 В в течение 35 минут.
Извлеките гель из кассеты и примените 50-вольтовый ток в течение как минимум одного часа, чтобы перенести разрешенные белки на 0,2-микрометровую нитроцеллюлозную мембрану. Наконец, выполните анализ вестерн-блоттинга для оценки белков. Гель SDS-PAGE, окрашенный серебром, демонстрирует общий профиль белка для каждой фракции.
Данные показывают, что более поздние фракции содержат больше белка и напоминают материал 100R. Вестерн-блоты, обнаруживающие LAM, LpqH и GroES, демонстрируют, что белковые маркеры изменяются во всех фракциях. Здесь показана просвечивающая электронная микроскопия, или изображения ТЭМ, фракций SEC от 1 до 3, вытянутых перед фиксацией.
Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было отрицательно окрашено для визуализации TEM. Здесь показан анализ отслеживания наночастиц, или распределение NTA, фракций SEC от 1 до 3. Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было проанализировано с помощью анализа отслеживания наночастиц, и распределение размеров отображается здесь.
Этот протокол был оптимизирован для очистки EV от трех миллиграммов 100R. Если белковая нагрузка варьируется, рекомендуемая стратегия разбавления и BCA на полученных фракциях может потребовать корректировки. Mtb EV, приготовленные с помощью этого метода, могут быть использованы для последующих композиционных и омических исследований.
Они также подходят для экспериментов in vitro и in vivo. Этот метод обеспечивает легкий и эффективный способ производства высококачественных препаратов Mtb EV, прокладывая путь для повышения воспроизводимости в будущих экспериментах Mtb EV.
