Este protocolo reduz a complexidade técnica e o tempo necessários para o enriquecimento de vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis, EVs Mtb. Ele fornece uma alternativa suave às técnicas tradicionais de ultracentrifugação e densidade. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de realizar, tornando-a mais reproduzível.
Ele fornece um alto rendimento de EVs Mtb com co-enriquecimento mínimo de proteína não-EV. Demonstrando o procedimento será Joanie Ryan, uma ex-estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para começar, prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton adicionando a capacidade total de volume de PBS.
Centrífuga por cinco minutos a 2.800 vezes G a 4 graus Celsius. Descarte o fluxo através de qualquer PBS restante, e encha a câmara de amostra com Mtb CFP à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 vezes G a 4 graus Celsius até que o volume tenha reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração.
Repita conforme necessário até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente. Adicione 1X PBS à unidade do filtro que contenha o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume como descrito anteriormente e repita esta etapa cinco vezes para garantir a completa troca de lavagem e tampão.
Em seguida, recupere o retentato CFP concentrado de 100 quilodalton ou 100R, de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração. Lave o filtro com um volume mínimo de 1X PBS pelo menos três vezes e puxe a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação. Utilize várias diluições de amostras em PBS e quantita o material de 100R com um ensaio bicinchonínico.
Teste a amostra em triplicado. Permita que a cromatografia de exclusão de tamanho, ou coluna SEC, se equilibre à temperatura ambiente. Ligue a AFC usando o interruptor de alimentação na parte de trás da unidade da torre e pressione a configuração na tela de toque do menu principal, se necessário, para ajustar as configurações da célula de carga.
Na tela de configuração, alinhe o carrossel selecionando Carrossel seguido de Calibrate. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para a torre AFC e ajuste o carrossel pressionando os botões menos ou mais para que o bocal de fluido esteja diretamente acima da posição de descarga. Remova as tampas da coluna SEC equilibrada e deslize a coluna SEC para o suporte de coluna apropriado.
Instale-o cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a etiqueta de identificação de radiofrequência na coluna está em faces da AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque a tubulação de saída de resíduos em um recipiente de coleta.
Na tela de configuração, selecione O Cronograma de Coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mililitros pressionando os botões menos ou mais. Deixe a configuração do volume do buffer como padrão de 2,7 mililitros e, em seguida, feche a janela do cronograma de coleta. Selecione Start Collection na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando Sim.
Carga 13 rotulados tubos de microcentrífugo de 1,7 mililitro com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel. Avance a AFC selecionando OK, em seguida, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção de lavar a coluna pressionando Sim e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 micrômetro para remover qualquer buffer de armazenamento. Uma vez que a descarga esteja completa, avance a AFC pressionando OK. Coloque a tampa do carrossel sobre a AFC e pressione OK. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.
Leve três miligramas de amostra de 100R a 500 microliters com PBS 1X e adicione a amostra ao topo da coluna. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 micrômetro. Avance a AFC e deixe a amostra correr para o traste.
Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado anteriormente ao reservatório. Monitore a execução da AFC enquanto ela coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a execução completa e o carrossel retorna à posição de resíduo, remova a tampa e os tubos de fração do carrossel.
Para frações de 0,5 milímetros coletadas a partir de três miligramas de CFP de 100R Mtb, meça a concentração de proteína utilizando o micro-BCA com uma diluição de 1:3 para frações numeradas de 1 a 7 de cada amostra em triplicado. Para 0,5 mililitros frações numeradas de 5 a 13, use o BCA sem diluição para cada amostra em triplicado. Adicione buffer de amostra SDS a 10 microliters de cada fração e cinco microgramas de CFP e 100R.
Ferva por cinco minutos a 100 graus Celsius. Em seguida, carregue em um gel bis-tris de 4 a 12% com uma escada de peso molecular para eletroforese de gel de poliacrilamida, ou PAGE. Execute um gel SDS-PAGE usando buffer de execução 1X MES e uma corrente de 200 volts por 35 minutos.
Remova o gel do e aplique uma corrente de 50 volts por um mínimo de uma hora para transferir as proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 micrômetro. Finalmente, realize a análise de manchas ocidentais para avaliar as proteínas. Um gel SDS-PAGE manchado de prata demonstra o perfil geral de proteína para cada fração.
Os dados mostram que as frações posteriores contêm mais proteína e se assemelham ao material 100R. Manchas ocidentais detectando LAM, LpqH e GroES demonstram que o marcador de proteína muda através das frações. Microscopia eletrônica de transmissão, ou imagens TEM, de frações SEC 1 a 3 puxadas antes da fixação são mostradas aqui.
A ultracentrifugação de gradiente de densidade de EVs Mtb foi manchada negativamente para imagens TEM. A análise de rastreamento de nanopartículas, ou distribuição NTA, das frações SEC 1 a 3 é mostrada aqui. Os EVs Mtb de ultracentrifugação de gradiente de densidade foram analisados com análise de rastreamento de nanopartículas, e a distribuição de tamanho é exibida aqui.
Este protocolo foi otimizado para purificação de EV a partir de três miligramas de 100R. Se a carga proteica for variada, a estratégia recomendada de diluição e BCA sobre frações resultantes pode exigir ajuste. Os EVs Mtb preparados com esta técnica podem ser usados para estudos composicionais a jusante e baseados em omics.
Eles também são adequados para experimentos in vitro e in vivo. Esta técnica fornece uma maneira fácil e eficiente de produzir preparações de EV Mtb de alta qualidade, abrindo caminho para maior reprodutibilidade em futuros experimentos de EV Mtb.
