يقلل هذا البروتوكول من التعقيد التقني والوقت اللازم لإثراء الحويصلات خارج الخلية من المتفطرة السلية ، Mtb EVs. يوفر بديلا لطيفا للطرد المركزي الفائق التقليدي والتقنيات القائمة على الكثافة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء ، مما يجعلها أكثر قابلية للتكرار.
يوفر إنتاجية عالية من Mtb EVs مع الحد الأدنى من التخصيب المشترك للبروتين غير EV. ستوضح الإجراء جواني رايان ، وهي طالبة دراسات عليا سابقة في مختبرنا. للبدء ، قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي يبلغ 100 كيلودالتون عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة ل PBS.
جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 2،800 مرة G عند 4 درجات مئوية. تخلص من التدفق وأي PBS متبقي ، واملأ غرفة العينة ب Mtb CFP إلى سعتها القصوى. جهاز طرد مركزي عند 2،800 مرة G عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق.
كرر حسب الضرورة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف. أضف 1X PBS إلى وحدة التصفية التي تحتوي على التركيز حتى إجمالي سعة الجهاز. قلل مستوى الصوت كما هو موضح من قبل وكرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل وتبديل المخزن المؤقت.
بعد ذلك ، قم باستعادة 100 كيلودالتون مركز CFP retentate أو 100R ، وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق. اغسل الفلتر بأقل حجم 1X PBS ثلاث مرات على الأقل ، واسحب الغسيل باستخدام 100R لتحقيق أقصى قدر من الاسترداد. استخدم عدة تخفيفات للعينات في PBS وقم بقياس كمية مادة 100R باستخدام فحص bicinchoninic.
اختبار العينة في ثلاثة أضعاف. اسمح لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، أو عمود SEC، بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل AFC باستخدام مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من وحدة البرج واضغط على الإعداد على شاشة اللمس في القائمة الرئيسية إذا لزم الأمر لضبط إعدادات خلية التحميل.
من شاشة الإعداد، قم بمحاذاة الدوار عن طريق تحديد دائري متبوعا بمعايرة. أدخل الدوار مع 13 ثقبا صغيرا متجها إلى أعلى في برج AFC واضبط الدوار عن طريق الضغط على زري ناقص أو زائد بحيث تكون فوهة السائل فوق موضع التدفق مباشرة. قم بإزالة الأحرف الكبيرة من عمود SEC المتوازن وحرك عمود SEC في حامل العمود المناسب.
قم بتثبيته بعناية على برج الاتحاد الآسيوي لكرة القدم. تأكد من أن علامة تعريف التردد اللاسلكي الموجودة على العمود تواجه AFC، وتحقق من أن الاتصال بين العمود والصمام آمن. ضع أنبوب مخرج النفايات في حاوية تجميع.
من شاشة الإعداد، حدد جدول التجميع واضبط العدد على 13 والحجم على 0.5 ملليلتر بالضغط على زري ناقص أو زائد. اترك إعداد وحدة تخزين التخزين المؤقت كإعداد افتراضي ل 2.7 ملليلتر ثم أغلق نافذة جدول التجميع. حدد بدء المجموعة من الشاشة الرئيسية وقم بتأكيد معلمات المجموعة عن طريق تحديد نعم.
تحميل 13 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر مع فتح الأغطية والإشارة نحو مركز دائري. تقدم AFC عن طريق تحديد OK ، ثم قم بتركيب خزان العمود والتقدم مرة أخرى عن طريق الضغط على OK. حدد خيار مسح العمود بالضغط على نعم، وأضف وحدة تخزين عمود واحدة بحجم 0.2 ميكرومتر PBS تمت تصفيتها لإزالة أي مخزن مؤقت للتخزين. بمجرد اكتمال التدفق ، تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم عن طريق الضغط على موافق. ضع الغطاء الدوار فوق الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واضغط على موافق. استخدم ماصة لإزالة أي مخزن مؤقت زائد من العمود.
أحضر ثلاثة ملليغرام من عينة 100R إلى 500 ميكرولتر باستخدام 1X PBS وأضف العينة إلى أعلى العمود. قم بإعداد حجم عمود واحد من 0.2 ميكرومتر PBS المصفاة. تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واسمح للعينة بالدخول في القلق.
بمجرد دخول العينة بالكامل إلى العمود ، أضف PBS المعد مسبقا إلى الخزان. راقب سير عمل الاتحاد الآسيوي لكرة القدم أثناء قيامه أولا بجمع حجم الفراغ ثم الكسور المحددة. بعد اكتمال التشغيل وعودة الدوار إلى وضع النفايات ، قم بإزالة الغطاء وأنابيب الكسر من الدوار.
بالنسبة لكسور 0.5 ملم التي تم جمعها من ثلاثة ملليغرامات من 100R Mtb CFP ، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام micro-BCA مع تخفيف 1: 3 للكسور المرقمة من 1 إلى 7 من كل عينة في ثلاثة أضعاف. بالنسبة لكسور 0.5 ملليلتر المرقمة من 5 إلى 13 ، استخدم BCA بدون تخفيف لكل عينة في ثلاثة أضعاف. أضف مخزن عينة SDS إلى 10 ميكرولترات من كل جزء وخمسة ميكروغرامات من CFP و 100R.
تغلي لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية. ثم قم بالتحميل على هلام Bis-Tris من 4 إلى 12٪ مع سلم الوزن الجزيئي للرحلان الكهربائي لهلام polyacrylamide ، أو PAGE. قم بتشغيل هلام SDS-PAGE باستخدام مخزن مؤقت يعمل 1X MES وتيار 200 فولت لمدة 35 دقيقة.
قم بإزالة الجل من الكاسيت وتطبيق تيار 50 فولت لمدة ساعة واحدة على الأقل لنقل البروتينات التي تم حلها إلى غشاء نيتروسليلوز 0.2 ميكرومتر. أخيرا ، قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتقييم البروتينات. يوضح جل SDS-PAGE الملطخ بالفضة الشكل الكلي للبروتين لكل كسر.
تظهر البيانات أن الكسور اللاحقة تحتوي على المزيد من البروتين وتشبه مادة 100R. تظهر البقع الغربية التي تكتشف LAM و LpqH و GroES أن علامة البروتين تتغير عبر الكسور. يظهر هنا المجهر الإلكتروني للإرسال، أو صور TEM، لكسور SEC من 1 إلى 3 التي تم سحبها قبل التثبيت.
كان الطرد المركزي المتدرج للكثافة لمركبات Mtb EVs ملطخا سلبا لتصوير TEM. يظهر هنا تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو توزيع NTA ، لكسور SEC من 1 إلى 3. تم تحليل الطرد المركزي الفائق التدرج في الكثافة Mtb EVs باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ويتم عرض توزيع الحجم هنا.
تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية EV من ثلاثة ملليغرام من 100R. إذا كان حمل البروتين متنوعا ، فقد يتطلب التخفيف الموصى به واستراتيجية BCA على الكسور الناتجة تعديلا. يمكن استخدام المركبات الكهربائية Mtb المعدة بهذه التقنية للدراسات التركيبية والقائمة على omics في المراحل النهائية.
كما أنها مناسبة للتجارب في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه التقنية طريقة سهلة وفعالة لإنتاج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة ، مما يمهد الطريق لزيادة قابلية التكرار في تجارب Mtb EV المستقبلية.
