这种方法将有助于研究人员研究生活在女性生殖道中并导致感染的厌氧菌的生物学和病理生理学。以前的小鼠阴道接种模型侧重于在有氧条件下生长和恢复的细菌。我们的方法指导专性厌氧细菌的接种和回收，这需要额外的策略来最大限度地减少氧气暴露。
根据它们的挑剔程度，该模型中使用的新细菌菌株可能需要更改某些步骤。我们在手稿的表一中提供了可能修改的建议。首先，在厌氧室中将 200 微升 16 小时大的细菌培养物加入 1.5 毫升比色皿中，加入 800 微升新鲜培养基。
然后在分光光度计中测量600纳米稀释培养物的光密度或OD，使用单独的比色皿，仅将培养基作为空白。要获得培养物的实际OD值，请将分光光度计读数乘以5，然后确定实验所需的接种物体积并计算达到所需接种物密度所需的细菌培养物体积。接下来，将所需体积的细菌培养物移液到无菌微量离心管中，并以16， 000倍G离心一至三分钟。
除去上清液后，将沉淀重悬于厌氧PBS中，以达到之前计算的所需接种量。为了确定制备的接种物中细菌菌落形成单位的数量，首先，使用10微升细菌悬浮液在PBS中进行多次连续稀释，并使用多通道移液器在琼脂平板上点定平板接种稀释液。同时，通过将70微升无菌厌氧PBS移液到标有小鼠编号的1.5毫升微量离心管中，准备厌氧室中的阴道灌洗管。
紧紧关闭管子并将它们取出腔室。要进行阴道灌洗，首先，将一只老鼠放在笼子的顶部，它可以用前爪抓住它。然后，轻轻握住尾巴的中间部分并将其抬起，使后躯略微抬高并露出阴道口。
从标记的清洗管中吸取 50 微升 PBS 后，轻轻地将移液器吸头插入阴道腔 2 到 3 毫米，通过移入和移出三到四次用 PBS 清洗。然后，将洗涤材料与剩余的 20 微升未使用的 PBS 一起转移回原始洗涤管。在阴道灌洗后，立即通过阴道转移20微升细菌悬浮液或载体对照来接种每只小鼠。
对于两种不同细菌菌株的共同接种实验，分别接种10微升每种细菌悬浮液，而不是事先混合菌株。为防止给药量立即在阴道口积聚，请继续保持小鼠的后部 10 到 20 秒。将接种的小鼠转移到新的笼子或已经接种的笼子伴侣中，并与其他小鼠重复该过程。
接种所有小鼠后，通过在厌氧室中接种接种物的连续稀释液来获得接种后的集落形成单位。为了收集小鼠器官，通过在阴道和宫颈的每个管中加入一毫升无菌厌氧PBS来在厌氧室中制备五毫升器官收集管。将750毫升PBS添加到标记为子宫角的管中。
为了在牺牲时收集最后的灌洗，请准备另一组阴道灌洗管，如前所述。此外，对于冲洗和灭菌解剖仪器，准备 50 毫升去离子水烧杯和 50 毫升 70% 至 90% 乙醇烧杯。在牺牲小鼠之前或之后，如前所述进行最后的灌洗。
处死后，用70%乙醇喷洒小鼠的腹部和背部。然后，使用乙醇灭菌和干燥的剪刀用垂直切口打开小鼠的腹盆腔。接下来，用镊子拉回皮肤。
要暴露生殖道，轻轻地将肠子从体腔中推到空旷的一侧，并从小鼠身上取出膀胱以进入生殖道的下部。之后，用剪刀夹住耻骨的中心，不要剪开阴道。然后，用两组镊子抓住骨盆的每一侧，将骨盆横向拉开，露出下面的阴道下部。
用镊子轻轻抓住子宫颈并将其向上拉以露出结肠。之后，用小剪刀将阴道从外部结缔组织中释放出来。小心地将阴道从结肠中释放出来，不要刺穿肠道。
当阴道从结肠中完全释放出来时，用剪刀在阴道的内侧，然后剪将其从小鼠体内取出。保持对子宫颈的轻柔抓握，将其向上拉，使子宫角更明显，并直接切开左右两侧的卵巢下方以释放子宫角。接下来，从小鼠体内取出生殖道并将其放入无菌培养皿中。
然后，使用剃须刀片将子宫角、子宫颈和阴道分开。将每个组织放入其各自标记的收集管中。为了均质器官，请在生物安全柜中准备好手持式均质机。
首先，分别用去离子水，70%乙醇和PBS准备一组三个50毫升管，以便在均质化每个器官后清洗均质器刀片。要清洁均质机，请将刀片浸入水管中，然后全速打开机器约三秒钟。然后，在纸巾上摇晃刀片以去除多余的水。
依次用70%乙醇和PBS冲洗刀片。初始冲洗后，将均质器探针降低到带有器官的管底部，以将组织捕获在下面。然后，打开均质机研磨组织，轻轻上下移动探针约五次，使其浸没。
关闭并取出均质器，目视确保组织完全破碎。均质化后，将样品循环回厌氧室并进行连续稀释以进行CFU回收。按照该协议，可以成功地从阴道洗涤中回收活细菌并枚举菌落形成单位，用于细菌菌株，阴道加德纳菌，双普雷沃氏菌和核梭杆菌。
此外，从阴道洗涤中获得的阴道加德纳菌菌落形成单位的数量与从阴道组织匀浆中回收的单位数量相关。该方法还显示，与普雷沃氏菌单感染相比，在与阴道加德纳菌混合感染期间，普雷沃氏菌的双维亚滴度和小鼠子宫组织显着更高。此外，该方法可以成功地用于比较突变型梭杆菌核菌株与野生型在接种后24和72小时的阴道持久性。
为了研究对阴道细菌接种的免疫反应，可以在组织匀浆上进行细胞因子测定。或者，可以保存组织进行组织学检查，以评估炎症迹象。
