Diese Methode wird den Forschern helfen, die Biologie und Pathophysiologie von anaeroben Bakterien zu untersuchen, die im weiblichen Fortpflanzungstrakt leben und Infektionen verursachen. Frühere Modelle der murinen vaginalen Impfung konzentrierten sich auf Bakterien, die unter aeroben Bedingungen gezüchtet und sich erholt haben. Unsere Methode befasst sich mit der Impfung und Rückgewinnung von obligat anaeroben Bakterien, die zusätzliche Strategien zur Minimierung der Sauerstoffbelastung erfordern.
Je nachdem, wie anspruchsvoll sie sind, können neue Bakterienstämme, die in diesem Modell verwendet werden, Änderungen an bestimmten Schritten erfordern. In Tabelle eins des Manuskripts haben wir Vorschläge für mögliche Änderungen gemacht. Geben Sie zunächst 200 Mikroliter einer 16 Stunden alten Bakterienkultur in eine 1,5-Milliliter-Küvette mit 800 Mikrolitern frischem Medium in einer anaeroben Kammer.
Dann wurde die optische Dichte (OD) der verdünnten Kultur bei 600 Nanometern in einem Spektralphotometer gemessen, wobei eine separate Küvette mit nur Medium als Leerwert verwendet wurde. Um den tatsächlichen OD-Wert der Kultur zu erhalten, multiplizieren Sie den Spektralphotometerwert mit fünf, bestimmen Sie dann das für das Experiment erforderliche Inokulumvolumen und berechnen Sie das Volumen der Bakterienkultur, das benötigt wird, um die erforderliche Inokulumdichte zu erreichen. Als nächstes pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Bakterienkultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren bei 16.000 mal G für ein bis drei Minuten.
Nach dem Entfernen des Überstands wird das Pellet in anaerobem PBS resuspendiert, um das zuvor berechnete erforderliche Inokulumvolumen zu erreichen. Um die Anzahl der bakterienkoloniebildenden Einheiten im vorbereiteten Inokulum zu bestimmen, werden zunächst 10 Mikroliter der Bakteriensuspension verwendet, um mehrere serielle Verdünnungen in PBS vorzunehmen, und eine Mehrkanalpipette verwendet, um Platteninokulumverdünnungen auf Agarplatten zu erkennen. Bereiten Sie gleichzeitig die vaginalen Lavageschläuche in der anaeroben Kammer vor, indem Sie 70 Mikroliter steriles anaerobes PBS in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, die mit Mausnummern gekennzeichnet sind.
Verschließen Sie die Röhrchen fest und nehmen Sie sie aus der Kammer. Um eine vaginale Spülung durchzuführen, legen Sie zuerst eine Maus auf einen Käfig, den sie mit ihren Vorderpfoten greifen kann. Fassen Sie dann vorsichtig den mittleren Teil des Schwanzes und heben Sie ihn an, so dass die Hinterviertel leicht erhöht sind und die Vaginalöffnung freiliegt.
Nachdem Sie 50 Mikroliter PBS aus dem etikettierten Waschschlauch entnommen haben, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig zwei bis drei Millimeter in das Vaginallumen ein, um sie mit PBS zu waschen, indem Sie drei- bis viermal ein- und auspipettieren. Anschließend wird das Waschmaterial mit den restlichen 20 Mikrolitern ungenutztem PBS wieder in den ursprünglichen Waschschlauch überführt. Unmittelbar nach dieser vaginalen Spülung impfen Sie jede Maus, indem Sie 20 Mikroliter der Bakteriensuspension oder Vehikelkontrolle vaginal übertragen.
Bei Co-Inco-Inokulationsexperimenten mit zwei verschiedenen Bakterienstämmen sollten Sie separat mit 10 Mikrolitern jeder Bakteriensuspension impfen, anstatt die Stämme vorher zu mischen. Um zu verhindern, dass sich das verabreichte Volumen sofort am vaginalen Introitus ansammelt, halten Sie den Hinterteil der Maus 10 bis 20 Sekunden lang hoch. Setzen Sie die beimpfte Maus in einen neuen Käfig oder mit bereits beimpften Käfigkameraden und wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen Mäusen.
Nachdem Sie alle Mäuse geimpft haben, erhalten Sie die koloniebildenden Einheiten nach dem Inokulum, indem Sie serielle Verdünnungen des Inokulums in der anaeroben Kammer plattieren. Um Mausorgane zu sammeln, bereiten Sie fünf Milliliter Organentnahmeröhrchen in der anaeroben Kammer vor, indem Sie jedem Röhrchen einen Milliliter steriles anaerobes PBS für Vaginas und Gebärmutterhals hinzufügen. Fügen Sie 750 Milliliter PBS zu den für Gebärmutterhörner markierten Röhrchen hinzu.
Um die letzte Lavage beim Opfer zu sammeln, bereiten Sie einen weiteren Satz vaginaler Lavageschläuche vor, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie zum Spülen und Sterilisieren von Sezierinstrumenten auch ein 50-Milliliter-Becherglas mit entionisiertem Wasser und ein 50-Milliliter-Becherglas mit 70 bis 90% Ethanol vor. Unmittelbar vor oder nach dem Opfern der Mäuse führen Sie die letzte Spülung durch, wie zuvor gezeigt.
Besprühen Sie nach der Tötung den Bauch und den Rücken einer Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie dann eine mit Ethanol sterilisierte und getrocknete Schere, um die Bauchhöhle der Maus mit vertikalen Schnitten zu öffnen. Als nächstes verwenden Sie die Pinzette, um die Haut zurückzuziehen.
Um den Fortpflanzungstrakt freizulegen, schieben Sie den Darm vorsichtig aus der Körperhöhle an die Seite des offenen Feldes und entfernen Sie die Blase von der Maus, um in den unteren Teil des Fortpflanzungstraktes zu gelangen. Danach schneiden Sie die Mitte des Schambeins mit einer Schere ab, ohne die Vagina zu schneiden. Verwenden Sie dann zwei Pinzetten, um jede Seite des Beckens zu greifen, und ziehen Sie das Becken seitlich auf, um den unteren Teil der darunter liegenden Vagina freizulegen.
Fassen Sie den Gebärmutterhals vorsichtig mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn hoch, um den Dickdarm freizulegen. Danach verwenden Sie eine kleine Schere, um die Vagina vom äußeren Bindegewebe zu befreien. Lösen Sie die Vagina vorsichtig aus dem Dickdarm, ohne den Darmtrakt zu punktieren.
Wenn die Vagina vollständig aus dem Dickdarm befreit ist, verwenden Sie eine Schere, um die Vagina am Introitus zu flankieren, und schneiden Sie sie dann ab, um sie aus dem Mauskörper zu entfernen. Halten Sie den Gebärmutterhals sanft fest, ziehen Sie ihn nach oben, um die Gebärmutterhörner besser sichtbar zu machen, und schneiden Sie direkt unter den Eierstöcken auf der rechten und linken Seite, um die Gebärmutterhörner freizugeben. Als nächstes entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt aus dem Mauskörper und legen Sie ihn in eine sterile Petrischale.
Trennen Sie dann mit einer Rasierklinge die Gebärmutterhörner, den Gebärmutterhals und die Vagina. Legen Sie jedes Gewebe in das entsprechend gekennzeichnete Entnahmeröhrchen. Um die Organe zu homogenisieren, bereiten Sie einen tragbaren Homogenisator in einer Biosicherheitswerkbank vor.
Bereiten Sie zunächst einen Satz von drei 50-Milliliter-Röhrchen mit entionisiertem Wasser, 70% Ethanol bzw. PBS vor, um die Homogenisatorschaufeln nach der Homogenisierung jedes Organs zu waschen. Um den Homogenisator zu reinigen, tauchen Sie die Klinge in den Wasserschlauch und schalten Sie die Maschine etwa drei Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit ein. Schütteln Sie dann die Klinge auf einem Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
Spülen Sie die Klinge nacheinander in 70% Ethanol und PBS. Nach dem ersten Spülen senken Sie die Homogenisatorsonde auf den Boden eines Röhrchens mit Organen, um das darunter liegende Gewebe einzufangen. Schalten Sie dann den Homogenisator ein, um das Gewebe zu mahlen, und bewegen Sie die Sonde etwa fünfmal vorsichtig auf und ab, wobei Sie sie unter Wasser halten.
Schalten Sie den Homogenisator aus und entfernen Sie ihn und stellen Sie visuell sicher, dass das Gewebe vollständig zerstört wird. Nach der Homogenisierung wird die Probe wieder in die anaerobe Kammer geleitet und eine serielle Verdünnung zur Gewinnung von KBE durchgeführt. Nach diesem Protokoll konnte die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien und die Zählung von koloniebildenden Einheiten aus den vaginalen Waschungen für die Bakterienstämme Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum erfolgreich durchgeführt werden.
Darüber hinaus korrelierte die Anzahl der koloniebildenden Einheiten von Gardnerella vaginalis, die aus vaginalen Waschungen gewonnen wurden, mit denen, die aus den Vaginalgewebehomogenaten gewonnen wurden. Diese Methode zeigte auch, dass die Prevotella bivia-Titer und das Uterusgewebe der Maus während der Koinfektion mit Gardnerella vaginalis signifikant höher waren als die Prevotella-Monoinfektion. Darüber hinaus konnte diese Methode erfolgreich eingesetzt werden, um die vaginale Persistenz eines mutierten Fusobacterium nucleatum-Stammes mit der des Wildtyps 24 und 72 Stunden nach der Beimpfung zu vergleichen.
Um die Immunantwort auf vaginale bakterielle Impfungen zu untersuchen, können Zytokin-Assays an den Gewebehomogenaten durchgeführt werden. Alternativ könnten Gewebe für die histologische Untersuchung aufbewahrt werden, um Entzündungszeichen zu beurteilen.
