この方法は、研究者が女性の生殖管に生息し、感染症を引き起こす嫌気性細菌の生物学と病態生理学を研究するのに役立ちます。マウス膣接種の以前のモデルは、好気性条件下で増殖および回収された細菌に焦点を当てていました。私たちの方法は、酸素曝露を最小限に抑えるための追加の戦略を必要とする義務的な嫌気性細菌の接種と回収を指示します。
それらがどれほど潔癖であるかに応じて、このモデルで使用される新しい細菌株は、特定のステップの変更を必要とする場合があります。原稿の表1に潜在的な変更の提案を提供しました。まず、嫌気性チャンバー内の800マイクロリットルの新鮮な培地を入れた1.5ミリリットルのキュベットに、200マイクロリットルの16時間前の細菌培養物を加えます。
その後、分光光度計で600ナノメートルで希釈した培養物の光学濃度(OD)を測定し、ブランクとして培地のみを有する別のキュベットを用いた。培養物の実際のOD値を取得するには、分光光度計の読み取り値に5を掛けてから、実験に必要な接種材料の体積を決定し、必要な接種材料密度を達成するために必要な細菌培養物の量を計算します。次に、必要量の細菌培養物を滅菌マイクロ遠心チューブにピペットで入れ、16, 000倍Gで1〜3分間遠心分離します。
上清を除去した後、ペレットを嫌気性PBSに再懸濁して、前に計算された必要量の接種材料を達成します。調製した接種材料中の細菌コロニー形成単位の数を決定するには、まず、10マイクロリットルの細菌懸濁液を使用してPBSでいくつかの段階希釈を行い、マルチチャンネルピペットを使用して寒天プレート上のプレート接種材料希釈物を見つけます。同時に、70マイクロリットルの滅菌嫌気性PBSをマウス番号でラベル付けされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペッティングすることにより、嫌気室で膣洗浄チューブを準備します。
チューブをしっかりと閉じて、チャンバーから取り出します。膣洗浄を行うには、まず、前足でつかむことができるケージの上にマウスを置きます。次に、尾の中央部分をそっとつかみ、後肢がわずかに上昇して膣口が露出するように持ち上げます。
ラベルの付いた洗浄チューブから50マイクロリットルのPBSを引き出した後、ピペットチップを膣内腔に2〜3ミリメートル静かに挿入し、3〜4回ピペッティングしてPBSで洗浄します。次に、残りの20マイクロリットルの未使用のPBSとともに、洗浄材料を元の洗浄チューブに戻します。この膣洗浄の直後に、20マイクロリットルの細菌懸濁液またはビヒクルコントロールを経膣移すことによって各マウスに接種する。
2つの異なる細菌株の同時接種実験では、事前に菌株を混合するのではなく、各細菌懸濁液10マイクロリットルを別々に接種します。投与された量が膣のイントロイトにすぐに蓄積するのを防ぐために、マウスの後部を10〜20秒間保持し続けます。.接種したマウスを新しいケージまたはすでに接種したケージメイトに移し、他のマウスで手順を繰り返します。
全てのマウスに接種した後、接種材料の段階希釈液を嫌気性チャンバーにプレーティングすることにより接種後コロニー形成単位を得る。マウスの臓器を採取するには、膣および子宮頸部用の各チューブに1ミリリットルの滅菌嫌気性PBSを加えて、嫌気室に5ミリリットルの臓器採取チューブを準備します。子宮角用にマークされたチューブに750ミリリットルのPBSを追加します。
犠牲で最終的な洗浄を収集するために、前に示したように膣洗浄チューブの別のセットを準備します。また、解剖器具のすすぎや滅菌には、50ミリリットルの脱イオン水ビーカーと70〜90%エタノールの50ミリリットルのビーカーを用意してください。マウスを屠殺する直前または直後に、前に示したように最終洗浄を行う。
犠牲後、マウスの腹部と背中に70%エタノールをスプレーします。次に、エタノール滅菌および乾燥したハサミを使用して、マウスの腹腔を垂直方向の切り傷で開きます。次に、鉗子を使用して皮膚を引き戻します。
生殖管を露出させるには、腸を体腔からオープンフィールドの側面にそっと押し出し、マウスから膀胱を取り外して生殖管の下部にアクセスします。その後、膣を切らずにハサミで恥骨の中心をクリップします。次に、2セットの鉗子を使用して骨盤の両側をつかみ、骨盤を横方向に開いて、下の膣の下部を露出させます。
鉗子で子宮頸部をそっとつかみ、引き上げて結腸を露出させます。その後、小さなハサミを使って膣を外部結合組織から解放します。腸管を穿刺せずに結腸から膣を慎重に解放します。
膣が結腸から完全に解放されたら、ハサミを使用してイントロイトで膣の側面を移動し、次に切り取ってマウスの体から取り除きます。子宮頸部を優しく握ったまま引き上げて子宮角を目立たせ、左右の卵巣の真下を切って子宮角を解放します。次に、マウスの体から生殖管を取り外し、滅菌ペトリ皿に入れます。
次に、かみそりの刃を使用して、子宮角、子宮頸部、および膣を分離します。各組織をそれぞれのラベル付き収集チューブに入れます。臓器を均質化するには、バイオセーフティキャビネットにハンドヘルドホモジナイザーを用意します。
まず、各臓器をホモジナイズした後、ホモジナイザーブレードを洗浄するために、それぞれ脱イオン水、70%エタノール、およびPBSを入れた50ミリリットルチューブ3本のセットを準備します。ホモジナイザーを清掃するには、ブレードを水管に浸し、約3秒間フルスピードでマシンの電源を入れます。次に、ペーパータオルでブレードを振って余分な水分を取り除きます。
ブレードを70%エタノールとPBSで連続してすすぎます。最初のすすぎの後、ホモジナイザープローブを臓器の入ったチューブの底まで下げて、下の組織をトラップします。次に、ホモジナイザーの電源を入れて組織を粉砕し、プローブを水没させたまま約5回ゆっくりと上下に動かします。
ホモジナイザーの電源を切って取り外し、組織が完全に破壊されていることを視覚的に確認します。均質化後、サンプルを嫌気性チャンバーに戻し、CFU回収のために段階希釈を行います。このプロトコルに従って、生菌の回収と膣洗浄からのコロニー形成ユニットの列挙は、細菌株、ガードネレラ膣、プレボテラビビア、およびフソバクテリウムヌクレアタムに対して正常に行うことができます。
さらに、膣洗浄から得られたガードネレラ膣コロニー形成単位の数は、膣組織ホモジネートから回収されたものと相関した。また、この方法では、ガードネレラ膣との同時感染時とプレボテラ単感染時のプレボテラ・ビビア力価とマウス子宮組織が有意に高かった。さらに、この方法は、変異型フソバクテリウム核株の膣持続性を、接種後24時間および72時間における野生型のそれと比較することに成功しました。
膣内細菌接種に対する免疫応答を調べるために、サイトカインアッセイを組織ホモジネートで実行できます。あるいは、炎症の兆候を評価するための組織学的検査のために組織を保存することもできます。
