Этот метод поможет исследователям изучить биологию и патофизиологию анаэробных бактерий, которые живут и вызывают инфекции в женском репродуктивном тракте. Предыдущие модели мышиной вагинальной прививки были сосредоточены на бактериях, выращенных и восстановленных в аэробных условиях. Наш метод инструктирует по инокуляции и восстановлению облигатно анаэробных бактерий, которые требуют дополнительных стратегий для минимизации воздействия кислорода.
В зависимости от того, насколько они привередливы, новые бактериальные штаммы, используемые в этой модели, могут потребовать изменения определенных шагов. Мы предоставили предложения по возможным изменениям в таблице первой рукописи. Для начала добавьте 200 микролитров 16-часовой бактериальной культуры в 1,5-миллилитровую кювету с 800 микролитрами свежих сред в анаэробной камере.
Затем измеряли оптическую плотность, или OD, разбавленной культуры при 600 нанометрах в спектрофотометре, используя отдельную кювету только с носителем в качестве заготовки. Чтобы получить фактическое значение OD культуры, умножьте показания спектрофотометра на пять, затем определите объем инокулята, необходимый для эксперимента, и рассчитайте объем бактериальной культуры, необходимый для достижения требуемой плотности инокулята. Затем пипетку необходимого объема бактериальной культуры в стерильную микроцентрифужную трубку и центрифугу в 16 000 раз G в течение одной-трех минут.
После удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в анаэробном PBS для достижения необходимого объема инокулята, рассчитанного ранее. Чтобы определить количество бактериальных колониеобразующих единиц в подготовленном инокуляте, во-первых, используют 10 микролитров бактериальной суспензии, чтобы сделать несколько последовательных разведений в PBS и используют многоканальную пипетку для обнаружения разведения пластин инокулята на агаровых пластинах. В то же время подготовьте вагинальные промывные трубки в анаэробной камере путем пипетирования 70 микролитров стерильного анаэробного PBS в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, помеченные номерами мышей.
Плотно закройте трубки и выньте их из камеры. Для выполнения вагинального промывания, во-первых, поместите мышь поверх клетки, которую она может схватить передними лапами. Затем осторожно захватите среднюю часть хвоста и поднимите ее так, чтобы задние четверти были слегка приподняты и влагалищное отверстие было открыто.
После извлечения 50 микролитров PBS из меченой промывочной трубки аккуратно вставьте наконечник пипетки на два-три миллиметра во влагалищный просвет, чтобы промыть его PBS путем пипетки внутрь и наружу три-четыре раза. Затем перенесите моющий материал обратно в оригинальную промывочную трубку с оставшимися 20 микролитрами неиспользованной PBS. Сразу после этого промывания влагалища прививайте каждую мышь, вагинально передавая 20 микролитров бактериальной суспензии или контроля транспортного средства.
Для экспериментов по совместной вакцинации двумя различными бактериальными штаммами отдельно прививайте по 10 микролитров каждой бактериальной суспензии, а не смешивайте штаммы заранее. Чтобы предотвратить немедленное накопление введенного объема во влагалищном интроитусе, продолжайте удерживать заднюю часть мыши в течение 10-20 секунд. Перенесите привитую мышь в новую клетку или с уже привитыми товарищами по клетке и повторите процедуру с другими мышами.
После инокуляции всех мышей получают пост-инокулятивные колониеобразующие единицы путем покрытия последовательных разведений инокулята в анаэробной камере. Чтобы собрать органы мыши, подготовьте пятимиллилитрные трубки для сбора органов в анаэробной камере, добавив один миллилитр стерильного анаэробного PBS в каждую трубку для влагалища и шейки матки. Добавьте 750 миллилитров PBS в трубы, помеченные для маточных рогов.
Для сбора окончательного промывания при жертвоприношении подготовьте еще один набор вагинальных лаважных трубок, как показано ранее. Кроме того, для промывки и стерилизации инструментов для рассечения готовят 50-миллилитровый стакан деионизированной воды и 50-миллилитровый стакан от 70 до 90% этанола. Непосредственно перед или после жертвоприношения мышей выполните окончательное промывание, как показано ранее.
После жертвоприношения опрыскайте брюшко и спину мыши 70% этанолом. Затем используйте этанольно-стерилизованные и высушенные ножницы, чтобы открыть брюшную полость таза мыши вертикальными разрезами. Затем используйте щипцы, чтобы оттянуть кожу.
Чтобы обнажить репродуктивный тракт, осторожно вытолкните кишечник из полости тела в сторону открытого поля и удалите мочевой пузырь у мыши, чтобы получить доступ к нижней части репродуктивного тракта. После этого обрежьте центр лобковой кости ножницами, не разрезая влагалище. Затем используйте два набора щипцов, чтобы захватить каждую сторону таза и потянуть таз, открытый сбоку, чтобы обнажить нижнюю часть влагалища под ним.
Аккуратно захватите шейку матки щипцами и подтяните ее вверх, чтобы обнажить толстую кишку. После этого используйте небольшие ножницы, чтобы освободить влагалище от наружных соединительных тканей. Осторожно отпустите влагалище от толстой кишки, не проколовывая кишечный тракт.
Когда влагалище полностью освобождается от толстой кишки, используйте ножницы, чтобы обрамить влагалище в интроитусе, а затем разрезать, чтобы удалить его из тела мыши. Сохраняя мягкий захват шейки матки, подтяните ее вверх, чтобы сделать маточные рога более заметными и разрезайте прямо под яичниками с правой и левой стороны, чтобы освободить рога матки. Далее удалите репродуктивный тракт из тела мыши и поместите его в стерильную чашку Петри.
Затем, используя лезвие бритвы, отделите рога матки, шейку матки и влагалище. Поместите каждую ткань в соответствующую маркированную коллекционную трубку. Для гомогенизации органов сделайте ручной гомогенизатор готовым в шкафу биобезопасности.
Сначала подготовьте набор из трех 50-миллилитровых трубок с деионизированной водой, 70% этанолом и PBS соответственно для промывки лопастей гомогенизатора после гомогенизации каждого органа. Чтобы очистить гомогенизатор, окуните лезвие в водяную трубку и включите машину на полной скорости примерно на три секунды. Затем встряхните лезвие на бумажном полотенце, чтобы удалить лишнюю воду.
Промывайте лезвие последовательно в 70% этаноле и PBS. После первоначального промывания опустите зонд гомогенизатора на дно трубки с органами, чтобы захватить ткань под ней. Затем включите гомогенизатор, чтобы измельчить ткань и осторожно перемещайте зонд вверх и вниз примерно в пять раз, удерживая его под водой.
Выключите и извлеките гомогенизатор и визуально обеспечьте полное разрушение тканей. После гомогенизации циклического образца обратно в анаэробную камеру и выполните последовательное разбавление для восстановления КОЕ. Следуя этому протоколу, восстановление жизнеспособных бактерий и перечисление колониеобразующих единиц из влагалищных промываний могут быть успешно выполнены для бактериальных штаммов, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia и Fusobacterium nucleatum.
Кроме того, количество колониеобразующих единиц Gardnerella vaginalis, полученных из вагинальных промываний, коррелировало с теми, которые были извлечены из гомогенатов влагалищной ткани. Этот метод также показал, что титры Prevotella bivia и ткани матки мыши были значительно выше во время коинфекции Gardnerella vaginalis по сравнению с моноинфекцией Prevotella. Кроме того, этот метод может быть успешно использован для сравнения вагинальной стойкости мутантного штамма Fusobacterium nucleatum с диким типом через 24 и 72 часа после посева.
Чтобы исследовать иммунный ответ на вагинальную бактериальную прививку, цитокиновые анализы могут быть проведены на гомогенатах тканей. В качестве альтернативы, ткани могут быть сохранены для гистологического исследования для оценки признаков воспаления.
