שיטה זו תסייע לחוקרים לחקור את הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של חיידקים אנאירוביים החיים וגורמים לזיהומים במערכת הרבייה הנשית. מודלים קודמים של חיסון וגינלי התמקדו בחיידקים שגדלו והתאוששו בתנאים אירוביים. השיטה שלנו מדריכה על חיסון והחלמה של חיידקים אנאירוביים אלכסוניים, הדורשים אסטרטגיות נוספות כדי למזער את החשיפה לחמצן.
בהתאם למידת ההקפדה שלהם, זני חיידקים חדשים המשמשים במודל זה עשויים לדרוש שינויים בשלבים מסוימים. סיפקנו הצעות לשינויים אפשריים בטבלה הראשונה של כתב היד. ראשית, הוסף 200 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בת 16 שעות לקובט 1.5 מיליליטר עם 800 מיקרוליטר של מדיה טרייה בתא אנאירובי.
לאחר מכן מדד את הצפיפות האופטית, או OD, של התרבית המדוללת ב -600 ננומטר בספקטרופוטומטר, באמצעות קובטה נפרדת עם מדיה בלבד כריק. כדי לקבל את ערך ה-OD האמיתי של התרבית, הכפילו את קריאת הספקטרופוטומטר בחמש, ואז קבעו את נפח החיסון הדרוש לניסוי וחשבו את נפח תרבית החיידקים הדרוש להשגת צפיפות החיסון הנדרשת. לאחר מכן, פיפטה את הנפח הנדרש של תרבית חיידקים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G למשך דקה עד שלוש דקות.
לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-PBS אנאירובי כדי להשיג את נפח החיסון הנדרש שחושב לפני. כדי לקבוע את מספר היחידות יוצרות מושבת חיידקים באינוקולום המוכן, ראשית, השתמש ב -10 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים כדי לבצע מספר דילולים סדרתיים ב- PBS והשתמש בפיפטה רב ערוצית כדי לזהות דילול צלחות אינוקולום על צלחות אגר. במקביל, הכינו את צינורות שטיפת הנרתיק בתא האנאירובי על ידי החדרת 70 מיקרוליטר של PBS אנאירובי סטרילי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר המסומנים במספרי עכברים.
סגור את הצינורות בחוזקה והוציאו אותם מהחדר. לביצוע שטיפה נרתיקית, ראשית, הניחו עכבר על גבי כלוב שהוא יכול לתפוס בכפותיו הקדמיות. לאחר מכן, אחזו בעדינות בחלק האמצעי של הזנב והרימו אותו כך שהרבעים האחוריים מוגבהים מעט ופתח הנרתיק חשוף.
לאחר שאיבת 50 מיקרוליטר של PBS מצינור השטיפה המסומן, הכנס בעדינות את קצה הפיפטה שניים עד שלושה מילימטרים לתוך לומן הנרתיק כדי לשטוף אותו עם PBS על ידי פיפטינג פנימה והחוצה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן, העבירו את חומר הכביסה בחזרה לצינור הכביסה המקורי עם 20 המיקרוליטרים הנותרים של PBS שאינו בשימוש. מיד לאחר שטיפת נרתיק זו, לחסן כל עכבר על ידי העברה נרתיקית של 20 מיקרוליטר של המתלה החיידקי או בקרת הרכב.
לניסויי חיסון משותף עם שני זני חיידקים שונים, יש לחסן בנפרד עם 10 מיקרוליטר של כל תרחיף חיידקי, במקום לערבב את הזנים מראש. כדי למנוע הצטברות מיידית של הנפח הניתן באינטרואיטוס הנרתיק, המשך להחזיק את החלק האחורי של העכבר למשך 10 עד 20 שניות. העבירו את העכבר המחוסן לכלוב חדש או עם חברים לכלוב שכבר חוסנו, וחזרו על התהליך עם העכברים האחרים.
לאחר חיסון כל העכברים, קבל את היחידות יוצרות המושבה שלאחר החיסון על ידי ציפוי דילולים סדרתיים של האינוקולום בתא האנאירובי. כדי לאסוף איברי עכבר, הכינו צינורות איסוף איברים של חמישה מיליליטר בתא האנאירובי על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS אנאירובי סטרילי לכל צינור לנרתיק וצוואר הרחם. הוסף 750 מיליליטר של PBS לצינורות המסומנים עבור קרני הרחם.
לאיסוף השטיפה האחרונה בעת הקרבת הקורבן, הכינו סט נוסף של צינורות שטיפת נרתיק כפי שהודגם קודם לכן. כמו כן, עבור שטיפה ועיקור מכשירי דיסקציה, להכין 50 מיליליטר של מים deionized ו 50 מיליליטר של 70 עד 90% אתנול. מיד לפני או אחרי הקרבת העכברים, בצעו את השטיפה הסופית כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר ההקרבה, רססו את בטנו וגבו של עכבר באתנול 70%. לאחר מכן, השתמש במספריים מעוקרים ומיובשים אתנול כדי לפתוח את חלל האגן של העכבר עם חתכים אנכיים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור לאחור.
כדי לחשוף את מערכת הרבייה, לדחוף בעדינות את המעיים מתוך חלל הגוף לצד של השדה הפתוח ולהסיר את שלפוחית השתן מן העכבר כדי לגשת לחלק התחתון של מערכת הרבייה. לאחר מכן, קליפ את מרכז עצם הערווה עם מספריים מבלי לחתוך את הנרתיק. לאחר מכן, השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי לתפוס כל צד של האגן ולמשוך את האגן פתוח לרוחב כדי לחשוף את החלק התחתון של הנרתיק מתחת.
תפסו בעדינות את צוואר הרחם במלקחיים ומשכו אותו למעלה כדי לחשוף את המעי הגס. לאחר מכן, השתמש מספריים קטנים כדי לשחרר את הנרתיק מרקמות החיבור החיצוניות. בזהירות לשחרר את הנרתיק מן המעי הגס מבלי לנקב את מערכת העיכול.
כאשר הנרתיק משתחרר במלואו מהמעי הגס, השתמש במספריים כדי לאגף את הנרתיק באינטרואיטוס ולאחר מכן לחתוך כדי להסיר אותו מגוף העכבר. שמירה על אחיזה עדינה על צוואר הרחם, למשוך אותו למעלה כדי להפוך את קרני הרחם גלוי יותר לחתוך ישירות מתחת לשחלות בצד ימין ושמאל כדי לשחרר את קרני הרחם. לאחר מכן, הסר את מערכת הרבייה מגוף העכבר והניחו אותו בצלחת פטרי סטרילית.
לאחר מכן, באמצעות סכין גילוח, להפריד את קרני הרחם, צוואר הרחם, הנרתיק. הניחו כל רקמה בצינור האיסוף המסומן המתאים לה. עבור הומוגניזציה של האיברים, לעשות homogenizer כף יד מוכן בארון בטיחות ביולוגית.
ראשית, להכין קבוצה של שלושה צינורות 50 מיליליטר עם מים deionized, 70% אתנול, ו PBS, בהתאמה, לשטוף את להבי homogenizer לאחר הומוגניזציה של כל איבר. כדי לנקות את ההומוגנייזר, טבלו את הלהב בצינור המים והפעילו את המכונה במלוא המהירות למשך כשלוש שניות. לאחר מכן, נערו את הלהב על מגבת נייר כדי להסיר עודפי מים.
יש לשטוף את הלהב ברצף ב-70% אתנול ו-PBS. לאחר השטיפה הראשונית, הורידו את בדיקת ההומוגנייזר לתחתית צינור עם איברים כדי ללכוד את הרקמה מתחת. לאחר מכן, הפעל את ההומוגנייזר כדי לטחון את הרקמה והזז בעדינות את הבדיקה למעלה ולמטה כחמש פעמים, תוך שמירה על שקוע.
כבה והסר את ההומוגנייזר והבטח חזותית הפרעה מלאה לרקמות. לאחר הומוגניזציה, מחזור הדגימה בחזרה לתוך התא האנאירובי ולבצע דילול סדרתי להתאוששות CFU. בעקבות פרוטוקול זה, התאוששות של חיידקים בני קיימא וספירה של יחידות יוצרות מושבה מתרחיצי הנרתיק יכולה להיעשות בהצלחה עבור זני החיידקים, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, ו- Fusobacterium nucleatum.
יתר על כן, מספר היחידות יוצרות מושבת הנרתיק של גרדנרלה שהתקבלו משטיפות נרתיקיות היו בקורלציה עם אלה שנמצאו מההומוגנאטים של רקמת הנרתיק. שיטה זו גילתה גם כי הטיטרים של Prevotella bivia ורקמות הרחם של העכבר היו גבוהים משמעותית במהלך זיהום משותף עם Gardnerella vaginalis לעומת Prevotella mono-infection. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש בהצלחה כדי להשוות את ההתמדה בנרתיק של זן Fusobacterium nucleatum מוטנטי עם זה של סוג פראי 24 ו 72 שעות לאחר החיסון.
כדי לחקור את התגובה החיסונית לחיסון חיידקי בנרתיק, ניתן לבצע בדיקות ציטוקינים על הומוגנאטים ברקמות. לחלופין, ניתן לשמור רקמות לבדיקה היסטולוגית כדי להעריך סימנים של דלקת.
