Este método aborda los desafíos en la observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz, como una penetración tisular limitada de la solución de limpieza y la resolución real bajo microscopio confocal. La principal ventaja de esta técnica es una observación de la estructura de tejidos mucho más grandes desde una perspectiva macro, incluso indicaciones con tejidos duros y gruesos, como brotes erizados para adultos. Este método se aplica a la obtención de imágenes profundas de tejidos duros y gruesos en especies de plantas amplias.
Puede ayudar a acelerar el descubrimiento de nuevos fenómenos en la investigación biológica de plantas. Para empezar, corta las raíces con cuidado sin dañar las plantas y lávalas con agua para eliminar la suciedad. Ahora, use pinzas para pelar las viejas hojas exteriores.
Para evitar aplastar las células, use una navaja de un solo filo con un movimiento deslizante para cortar el tejido del brote, el meristemo apical o la panícula joven hasta la base. Si la posición del meristemo apical del brote o de la panícula joven no es visible, córtela por más tiempo. El brote de arroz tiene una sección transversal ovalada.
Use una navaja de afeitar de doble filo para afeitar un lado del óvalo finamente, en la dirección de su eje largo. Confirme la posición del meristemo apical del brote o la panícula joven por la aparición de un color blanco en la muestra y recorte el exceso de tejido. Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de solución fijadora.
Corta un trozo de película de parafina de 2,5 centímetros cuadrados y dale forma a una bola. Ahora, coloque estas bolas encima de las muestras para evitar que floten fuera de la solución fijadora. Coloque el tubo que contiene la muestra en un desecador.
Cierre la tapa del desecador y encienda la bomba de vacío para despresurizar lentamente el interior del desecador hasta que se alcance una presión de menos 0,095 megapascales. Después de cerrar el desecador a menos 0,095 megapascales, apague la bomba de vacío y déjela reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Abra ligeramente el desecador y lentamente vuelva a la presión atmosférica.
Si la muestra se fija correctamente, se hunde en la solución fijadora. Y si no se hunde, reduce la presión de nuevo. Retire la película de parafina.
Cierre la tapa y mantenga los tubos durante la noche a cuatro grados centígrados. Con toallitas sin pelusa, retire el exceso de solución fijadora de la muestra y fije la muestra en una bandeja vibratoria de microcortadoras con pegamento instantáneo. Coloque la muestra en una bandeja con el lado plano hacia abajo que se afeitó durante el muestreo y ajuste las condiciones de recorte de acuerdo con la muestra fija.
Ajuste la posición de la muestra con el botón de marcha atrás o adelante y el botón arriba o abajo y llene la bandeja con agua desionizada hasta que todas las muestras estén sumergidas. Después de llenar la bandeja, presione el botón de inicio y coloque las muestras recortadas en un portaobjetos de vidrio con una gota de PBS. Verifique la muestra que contiene el sitio objetivo bajo un microscopio estereoscópico y transfiera la muestra recortada a una placa de varios pocillos con un mililitro de PBS.
Retire el PBS de la placa de pocillos múltiples. Agregue PBS fresco y déjelo reposar durante un minuto. Elimine PBS y agregue el CS. Coloque la placa de pocillos múltiples que contiene la muestra en un desecador y cierre la tapa.
Luego encienda la bomba de vacío para despresurizar el interior del desecador hasta menos 0.09 megapascales, lentamente. Después de cerrar el desecador a menos 0,09 megapascales, apague la bomba de vacío y déjela reposar durante una hora a temperatura ambiente. Abra ligeramente el desecador y lentamente vuelva a la presión atmosférica.
Vierta agua desionizada en el espacio entre los pozos para evitar la evaporación del CS y almacene las placas de múltiples pocillos a temperatura ambiente en la oscuridad para su limpieza. Cuando el CS se vuelva verde, reemplácelo con una solución nueva. Las muestras no recortadas permanecieron verdes y no se volvieron transparentes después de tres meses de tratamiento con las muestras CS.In que se despegaron de todas las hojas, los nodos internos se volvieron blancos después de una semana, aunque los ganglios permanecieron verdes.
La muestra no se volvió transparente después de cuatro semanas. Las muestras recortadas a mano se volvieron blancas después de una semana de tratamiento con CS, pero no se volvieron transparentes después de cuatro semanas. Las muestras recortadas a 130 micrómetros de espesor se volvieron translúcidas después de una semana de tratamiento con CS.
La muestra fue casi transparente después de dos semanas. En el ganglio, la profundidad observable después de una semana del tratamiento con SC fue de menos 60 micrómetros y menos 90 micrómetros después de dos semanas. Las señales fluorescentes se observaron a una profundidad de menos 80 micrómetros a las tres semanas y a una profundidad de menos 100 micrómetros a las cuatro semanas.
En el entrenudo, se observaron señales fluorescentes a una profundidad de menos 60 micrómetros sin el tratamiento CS. La profundidad observable fue de menos 90 micrómetros después de una semana a tres semanas del tratamiento con SC y menos 100 micrómetros después de cuatro semanas. En las hojas se observaron señales fluorescentes a una profundidad de menos 90 micrómetros sin tratamiento de CS, pero el brillo fue más débil que otros tejidos.
Después de una semana, las señales eran más brillantes y observadas a una profundidad de menos 120 micrómetros. La expresión del factor de transcripción OS MASU 15 mOrange se observó en panícula joven, hoja, ganglio, entrenudo y fleurette. La clave es encontrar las mejores condiciones para las plantas o tejidos, por ejemplo, presión de período y vacío, o posición, y tratamiento de CS, tiempo, grosor, velocidad y solución de tinción adecuada.
La combinación de tecnología de temporización y curado permite la observación temporal espacial del patrón de expresión génica y la comunicación intercelular en múltiples tejidos de una sola sección.
