이 방법은 벼싹의 심층 형광 관찰의 문제(예: 투명화 용액의 제한된 조직 침투 및 컨포칼 현미경에서의 실제 해상도)와 같은 문제를 해결합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 거시적 관점에서 훨씬 큰 조직의 구조를 관찰하는 것이며, 심지어 성충 싹과 같은 단단하고 두꺼운 조직으로도 프롬프트합니다. 이 방법은 넓은 식물 종에서 단단하고 두꺼운 조직의 심층 이미징에 적용됩니다.
식물 생물학 연구에서 새로운 현상의 발견을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 식물을 손상시키지 않고 뿌리를 조심스럽게 자르고 물로 씻어 먼지를 제거하십시오. 이제 핀셋을 사용하여 오래된 바깥 쪽 잎을 벗겨냅니다.
세포가 부서지는 것을 피하려면 슬라이딩 동작이있는 단날 면도기를 사용하여 싹, 정점 분열 조직 또는 어린 원추형에서 기저부까지 조직을 자릅니다. 싹의 정점 분열 조직 또는 어린 원추형의 위치가 보이지 않으면 더 길게 자릅니다. 쌀 싹은 타원형 단면을 가지고 있습니다.
양날 면도기를 사용하여 타원형의 한쪽을 장축 방향으로 얇게 깎습니다. 샘플에서 흰색을 띠는 색으로 싹 꼭대기 분열 조직 또는 어린 원추형의 위치를 확인하고 과도한 조직을 잘라냅니다. 1 밀리리터의 고정 용액이 들어있는 1.5 밀리리터의 마이크로 원심 분리기 튜브에 샘플을 넣으십시오.
2.5 평방 센티미터의 파라핀 필름 조각을 자르고 공 모양으로 만듭니다. 이제 이 볼을 샘플 위에 놓아 고정 용액에서 떠다니는 것을 방지합니다. 샘플이 들어있는 튜브를 데시케이터에 넣습니다.
데시케이터의 뚜껑을 닫고 진공 펌프를 시작하여 마이너스 0.095메가파스칼 압력에 도달할 때까지 데시케이터 내부를 천천히 감압합니다. 마이너스 0.095 메가 파스칼에서 데시케이터를 닫은 후 진공 펌프를 끄고 실온에서 30 분 동안 그대로 두십시오. 데시케이터를 약간 열고 천천히 대기압으로 되돌립니다.
샘플이 올바르게 고정되면 고정 용액에 가라 앉습니다. 가라 앉지 않으면 압력을 다시 줄이십시오. 파라핀 필름을 제거하십시오.
뚜껑을 닫고 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 유지하십시오. 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 샘플에서 과도한 고정 용액을 제거하고 인스턴트 접착제로 진동하는 마이크로 슬라이서 트레이에 샘플을 고정합니다. 샘플링 중에 면도한 평평한 면이 아래로 향하도록 트레이에 샘플을 놓고 고정된 샘플에 따라 트리밍 조건을 설정합니다.
역방향 또는 앞으로 버튼과 위 또는 아래 버튼으로 샘플 위치를 조정하고 모든 샘플이 잠길 때까지 트레이에 탈이온수를 채웁니다. 트레이를 채운 후 시작 버튼을 누르고 잘린 샘플을 PBS 한 방울로 유리 슬라이드에 놓습니다. 실체 현미경으로 표적 부위가 포함된 샘플을 확인하고 트리밍된 샘플을 PBS 1밀리리터가 있는 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.
멀티웰 플레이트로부터 PBS를 제거한다. 신선한 PBS를 넣고 1 분 동안 그대로 두십시오. PBS를 제거하고 CS를 추가합니다. 샘플이 들어 있는 멀티웰 플레이트를 데시케이터에 넣고 뚜껑을 닫습니다.
그런 다음 진공 펌프를 시작하여 0.09메가파스칼을 천천히 마이너스할 때까지 데시케이터 내부를 감압합니다. 마이너스 0.09 메가 파스칼에서 데시케이터를 닫은 후 진공 펌프를 끄고 실온에서 1 시간 동안 그대로 두십시오. 데시케이터를 약간 열고 천천히 대기압으로 되돌립니다.
탈이온수를 웰 사이의 틈에 부어 CS의 증발을 방지하고 멀티웰 플레이트를 청소를 위해 어두운 곳에서 실온에 보관하십시오. CS가 녹색으로 바뀌면 새로운 솔루션으로 교체하십시오. 트리밍되지 않은 샘플은 녹색으로 유지되었으며 모든 잎에서 벗겨진 CS.In 샘플로 처리 한 후 3 개월 후에도 투명하지 않았으며 노드는 녹색으로 유지되었지만 노드 간 1 주일 후에 흰색으로 변했습니다.
샘플은 4 주 후에 투명하지 않았습니다. 손으로 손질 된 샘플은 CS 치료 1 주일 후에 흰색이되었지만 4 주 후에 투명하지 않았습니다. 130 마이크로미터 두께로 트리밍된 샘플은 CS 처리 1주일 후에 반투명해졌다.
샘플은 2주 후에 거의 투명했습니다. 노드에서 CS 처리 1 주일 후 관찰 가능한 깊이는 마이너스 60 마이크로 미터 및 2 주 후 마이너스 90 마이크로 미터였습니다. 형광 신호는 3 주에 마이너스 80 마이크로 미터의 깊이에서, 4 주에 마이너스 100 마이크로 미터의 깊이에서 관찰되었다.
노드 간에서, 형광 신호는 CS 처리없이 마이너스 60 마이크로 미터의 깊이에서 관찰되었다. 관찰가능한 깊이는 CS 처리 1주일 내지 3주 후에 마이너스 90마이크로미터, 4주 후에 마이너스 100마이크로미터였다. 잎에서 형광 신호는 CS 처리없이 마이너스 90 마이크로 미터의 깊이에서 관찰되었지만 밝기는 다른 조직보다 약했습니다.
일주일 후, 신호는 더 밝아졌고 마이너스 120 마이크로 미터의 깊이에서 관찰되었습니다. 전사인자 OS MASU 15 mOrange의 발현은 어린 원추꽃차례, 잎, 마디, 절간, 및 플뢰렛에서 관찰되었다. 핵심은 식물 또는 조직에 가장 적합한 조건, 예를 들어 기간 및 진공 압력, 또는 위치, CS 처리, 타이밍, 두께, 속도 및 적절한 염색 용액을 찾는 것입니다.
타이밍과 경화 기술의 조합은 단일 섹션의 여러 조직에서 유전자 발현 패턴과 세포 간 통신의 공간적 시간 관찰을 허용합니다.
