斑马鱼动物模型，用于研究对蜱唾液生物分子的过敏反应

问题是为什么只有一些暴露于蜱叮咬的人会出现过敏反应。对我们来说，阐明蜱唾液中的生物分子以及涉及这一过程的免疫机制是解决这个问题的关键。α-Gal综合征的斑马鱼动物模型再现了人类对蜱唾液的反应的行为模式和过敏反应。

这种实验方法促进了对蜱 - 宿主分子相互作用的理解，其中我们与α-Gal综合征相关的冲突以及与α-Gal抗体反应相关的合作，这些反应可以防止病原体感染。为了用蜱虫唾液处理鱼，将成年斑马鱼分为三个性别平衡的组。使用商业Gala1-3Gal-BSA 3或α-Gal作为阳性对照，PBS作为阴性对照。

对于唾液提取，使用半充血、无病原体的雌性蜱虫喂食豚鼠六到七天。用50微升注射器和0.33毫米针头在PBS中的2%盐酸毛果芸香碱溶液以pH 7.4处理蜱虫。使用安装在微量移液器上的 10 微升吸头从蜱下口收集唾液。

将唾液放入冰上的1.5毫升管中，并将其储存在零下80摄氏度。按照制造商的建议，使用BCA蛋白质检测试剂盒确定唾液蛋白浓度以确定要注射到鱼中的蛋白质量。将斑马鱼饲养在 27 摄氏度的流通水系统中，明暗循环为 14 至 10 小时。

接下来，每组选择10条鱼，雌雄比例相似，体重相似注射。通过浸入0.02%甲烷磺酸三卡因中短暂麻醉鱼。用镊子或手小心地将麻醉的鱼放在湿海绵上的半侧，尾鳍在右侧以相同的方向注射化合物以控制病变。

用装有1厘米，29号针头的100微升注射器在肌肉中皮内注射鱼群，距离尾鳍5毫米，与鱼体成45度角。注射后，将处理过的鱼放回淡水箱中，无需麻醉即可恢复。每天上午 9：30 喂鱼两次。

下午 1：30，每条鱼喂 50 至 70 微克干鱼，直到第二天。然后用研钵和研杵捣碎狗粮，从处理注射后的第二天到第八天的实验结束喂鱼。

对于样本收集，将安乐死的鱼固定在带有销钉的石蜡板上。当鳃仍然用血液冲洗时，使用装有一厘米，29号针头的0.5毫升注射器从鱼的鳃血管中收集血清。将收集的血清储存在 1.5 摄氏度的 20 毫升管中直至使用。

用手术刀刀片将鱼切成矢状，并评估内部病变。然后将每条鱼的肠和肾收集在单独的 1.5 毫升管中。使用 RNA 纯化试剂盒从肠道和肾脏中提取总 RNA。

根据制造商的说明，分析与免疫反应相关的基因的表达，使用RT-qPCR的逆转录混合物进行定量逆转录聚合酶链反应或RT-qPCR。对斑马鱼 GAPDH 的 mRNA cT 值进行归一化，并使用具有不等方差的学生 t 检验在组间进行比较。通过 ELISA 测定可识别血清样品中 α-Gal 的 IgM 抗体滴度。

使用酶标仪将抗体滴度记录为光密度450纳米值，并使用方差不等的学生t检验在组间进行比较。该斑马鱼模型允许表征和评估由于宿主对蜱唾液的反应及其对α-Gal综合征或AGS的影响而导致的各种过敏反应。此外，与对照鱼相比，在蜱唾液处理的鱼中观察到诸如缓慢游泳，躺在水箱底部以及不进食，振动或曲折运动等行为的改变。

在用蜱唾液处理的鱼中观察到过敏反应的显着发生率，显示出快速脱敏和耐受性。用蜱唾液处理的鱼的行为变化比仅用α-Gal处理的鱼更明显。通过RT-PCR对代表性免疫标志物的表达进行额外分析。

结果显示，与对照组相比，用唾液和α-Gal处理的鱼的斑马鱼组之间存在差异。此外，用唾液和α-Gal处理的斑马鱼产生了针对α-Gal的IgM抗体，其水平高于用PBS处理的鱼。注射治疗，评估过敏反应和行为，以及报告过敏反应造成的死鱼数量是该方案最重要的方面。

使用mRNA，蛋白质和微生物组水平的组学技术来表征对蜱唾液的反应，使我们能够识别该过程所涉及的关键生物分子。