La domanda è perché solo alcuni individui esposti a punture di zecca sviluppano reazioni allergiche. Per noi, chiarire le biomolecole nella saliva delle zecche e i meccanismi immunitari che coinvolgono questo processo è la chiave per affrontare questa domanda. Il modello animale zebrafish della sindrome alfa-Gal riproduce modelli comportamentali umani e reazioni allergiche in risposta alla saliva delle zecche.
Questo approccio sperimentale migliora la comprensione dell'interazione molecolare tick-host in cui abbiamo conflitti associati alla sindrome alfa-Gal e cooperazione associata alla risposta anticorpale all'alfa-Gal, che sono protettivi contro l'infezione patogena. Per trattare il pesce con la saliva delle zecche, distribuire il pesce zebra adulto in tre gruppi equilibrati dal punto di vista del genere. Utilizzare Gala1-3Gal-BSA 3 o alpha-Gal commerciali come controllo positivo e PBS come controllo negativo.
Per l'estrazione della saliva, utilizzare zecche femmine semi-gonfie, prive di agenti patogeni, alimentate per sei-sette giorni su porcellini d'India. Trattare il segno di spunta con cinque microlitri di una soluzione al 2% di pilocarpina cloridrato in PBS a pH 7,4 nell'emocele usando una siringa da 50 microlitri con un ago da 0,33 millimetri. Raccogliere la saliva dall'ipostoma delle zecche usando una punta da 10 microlitri montata su una micropipetta.
Metti la saliva in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio e conservala a meno 80 gradi Celsius. Determinare la concentrazione di proteine della saliva per stabilire la quantità di proteine da iniettare nel pesce utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA, seguendo le raccomandazioni del produttore. Mantenere il pesce zebra in un sistema di flusso d'acqua a 27 gradi Celsius con un ciclo luce-buio da 14 a 10 ore.
Quindi, selezionare 10 pesci per gruppo con un rapporto simile tra femmine e maschi e un peso simile per l'iniezione. Anestetizzare brevemente il pesce mediante immersione in metansolfonato di tricaina allo 0,02%. Posizionare il pesce anestetizzato sulla sua metà lato usando una pinza o le mani con attenzione, su una spugna bagnata, con la pinna caudale sul lato destro per iniettare i composti nella stessa direzione per controllare le lesioni.
Iniettare gruppi di pesci per via intradermica nel muscolo con una siringa da 100 microlitri dotata di un ago di un centimetro, calibro 29 a cinque millimetri dalla pinna caudale e un angolo di 45 gradi rispetto al corpo del pesce. Dopo l'iniezione, rimettere il pesce trattato in un serbatoio d'acqua dolce senza anestesia per il recupero. Dai da mangiare al pesce due volte al giorno alle 9:30.
e alle 13:30 con 50-70 microgrammi di mangime secco per pesce fino al secondo giorno. Quindi schiacciare il cibo per cani con un mortaio e un pestello per nutrire il pesce dal secondo giorno dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento l'ottavo giorno.
Per la raccolta dei campioni, fissare il pesce eutanasia su una piastra di paraffina con spilli. Raccogliere il siero dai vasi sanguigni branchiali del pesce quando le branchie sono ancora irrigate con sangue usando una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago da un centimetro, calibro 29. Conservare il siero raccolto in un tubo da 1,5 millilitri a 20 gradi Celsius fino all'uso.
Tagliare il pesce sagittalmente con una lama di bisturi e valutare le lesioni interne. Quindi raccogliere l'intestino e il rene di ciascun pesce in tubi separati da 1,5 millilitri. Estrarre l'RNA totale dall'intestino e dai reni utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.
Analizzare l'espressione di geni correlati alla risposta immunitaria, eseguendo una reazione a catena quantitativa a trascrizione inversa-polimerasi, o RT-qPCR utilizzando un mix di trascrizione inversa per RT-qPCR, secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare i valori di mRNA cT rispetto al GAPDH del pesce zebra e confrontare tra i gruppi utilizzando un test t di Student con varianza disuguale. Determinare i titoli anticorpali IgM che riconoscono alfa-Gal nei campioni di siero mediante ELISA.
Registrare i titoli anticorpali come valori di densità ottica di 450 nanometri utilizzando un lettore di piastre e confrontare tra gruppi utilizzando un test t di Student con varianza disuguale. Questo modello di zebrafish consente la caratterizzazione e la valutazione di varie reazioni allergiche dovute alla risposta dell'ospite alla saliva delle zecche e alla loro implicazione nella sindrome alfa-Gal, o AGS. Inoltre, rispetto al pesce di controllo, sono state osservate alterazioni nei comportamenti come il nuoto lento, sdraiarsi sul fondo della vasca e non mangiare, vibrare o zigzagare nei pesci trattati con saliva di zecca.
Un'incidenza significativa di reazioni allergiche è stata osservata nei pesci trattati con saliva di zecca, mostrando una rapida desensibilizzazione e tolleranza. Il cambiamento comportamentale era più pronunciato nei pesci trattati con saliva di zecca che con solo alfa-Gal. Un'ulteriore analisi dell'espressione dei marcatori immunitari rappresentativi è stata eseguita mediante RT-PCR.
I risultati hanno mostrato differenze tra i gruppi di zebrafish nel rene, dove i marcatori di risposta immunitaria erano sottoregolati nei pesci trattati con saliva e alfa-Gal rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, il pesce zebra trattato con saliva e alfa-Gal ha sviluppato anticorpi IgM contro alfa-Gal che hanno mostrato livelli più elevati rispetto ai pesci trattati con PBS. L'iniezione del trattamento, la valutazione delle reazioni allergiche e del comportamento e la segnalazione del numero di pesci morti da reazioni allergiche sono l'aspetto più importante del protocollo.
L'utilizzo di tecnologie omiche a livello di mRNA, proteine e microbioma per caratterizzare la risposta alla saliva delle zecche ci consente di identificare le biomolecole chiave coinvolte in questo processo.
