문제는 진드기에 물린 일부 사람들 만이 알레르기 반응을 일으키는 이유입니다. 우리에게는 진드기 타액의 생체 분자와 이 과정과 관련된 면역 메커니즘을 밝히는 것이 이 질문을 해결하는 열쇠입니다. 알파 갈 증후군의 제브라 피쉬 동물 모델은 진드기 타액에 대한 반응으로 인간의 행동 패턴과 알레르기 반응을 재현합니다.
이 실험적 접근 방식은 알파-갈 증후군과 관련된 갈등이 있는 진드기-숙주 분자 상호 작용 및 병원체 감염으로부터 보호하는 알파-갈에 대한 항체 반응과 관련된 협력에 대한 이해를 발전시킵니다. 진드기 타액으로 물고기를 치료하려면 성인 제브라 피쉬를 성별 균형 잡힌 세 그룹으로 나눕니다. 상업용 Gala1-3Gal-BSA 3 또는 alpha-Gal을 양성 대조군으로, PBS를 음성 대조군으로 사용하십시오.
타액 추출을 위해서는 기니피그에 6-7 일 동안 먹이를 준 반 충혈 된 병원균이없는 암컷 진드기를 사용하십시오. 0.33mm 바늘이 달린 50마이크로리터 주사기를 사용하여 pH 7.4의 PBS에 2% 필로카르핀 염산염 용액 5마이크로리터로 진드기를 헤모코엘로 처리합니다. 마이크로 피펫에 장착 된 10 마이크로 리터 팁을 사용하여 진드기 hypostom에서 타액을 수집합니다.
타액을 얼음 위의 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 타액 단백질 농도를 결정하여 제조업체의 권장 사항에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 물고기에 주입할 단백질의 양을 설정합니다. 제브라 피쉬를 섭씨 27도에서 14 시간에서 10 시간의 명암 주기로 흐르는 수계에 유지하십시오.
다음으로, 암컷과 수컷의 비율이 비슷하고 주사를 위해 비슷한 무게로 그룹당 10 마리의 물고기를 선택하십시오. 0.02% tricaine methanesulphonate에 담그면 물고기를 잠깐 마취하십시오. 젖은 스폰지에 집게나 손을 사용하여 마취된 물고기를 반쪽에 조심스럽게 놓고 꼬리 지느러미를 오른쪽에 놓고 같은 방향으로 화합물을 주입하여 병변을 조절합니다.
꼬리 지느러미에 5 밀리미터, 물고기의 몸에 45도 각도로 1 센티미터, 29 게이지 바늘이 장착 된 100 마이크로 리터 주사기로 근육에 물고기 그룹을 피내 주입하십시오. 주사 후, 처리 된 물고기를 회복을 위해 마취없이 담수 탱크에 다시 넣으십시오. 오전 9시 30분에 하루에 두 번 물고기에게 먹이를 줍니다.
오후 1시 30 분에 2 일째까지 물고기 당 50-70 마이크로 그램의 건어물 사료를 섭취합니다. 그런 다음 개밥을 박격포와 유봉으로 으깨서 치료 주사 후 2 일째부터 8 일째 실험이 끝날 때까지 물고기에게 먹이를줍니다.
샘플 수집을 위해 안락사 된 물고기를 핀으로 파라핀 플레이트에 고정하십시오. 아가미가 혈액으로 관개 될 때 1 센티미터, 29 게이지 바늘이 장착 된 0.5 밀리리터 주사기를 사용하여 물고기의 아가미 혈관에서 혈청을 수집하십시오. 수집 된 혈청을 섭씨 20 도의 1.5 밀리리터 튜브에 보관할 때까지 보관하십시오.
메스 칼날로 물고기를 시상으로 자르고 내부 병변을 평가하십시오. 그런 다음 각 물고기의 장과 신장을 별도의 1.5 밀리리터 튜브에 모으십시오. RNA 정제 키트를 사용하여 장과 신장에서 총 RNA를 추출합니다.
면역반응과 관련된 유전자의 발현을 분석하고, 제조사의 지시에 따라 정량적 역전사-중합효소연쇄반응 또는 RT-qPCR용 역전사 믹스를 이용하여 RT-qPCR을 수행한다. 제브라피쉬 GAPDH에 대해 mRNA cT 값을 정규화하고 분산이 같지 않은 Student t-검정을 사용하여 그룹 간에 비교합니다. 혈청에서 알파-Gal을 인식하는 IgM 항체 역가를 결정합니다.ampELISA로amp르.
플레이트 리더를 사용하여 항체 역가를 광학 밀도 450나노미터 값으로 기록하고 분산이 같지 않은 Student t-검정을 사용하여 그룹 간에 비교합니다. 이 제브라피쉬 모델을 사용하면 진드기 타액에 대한 숙주 반응과 알파-갈 증후군(AGS)에 미치는 영향으로 인한 다양한 알레르기 반응의 특성화 및 평가를 수행할 수 있습니다. 또한, 대조군 물고기와 비교하여, 진드기 타액 처리 물고기에서 느린 수영, 탱크 바닥에 누워, 먹지 않기, 진동 또는 지그재그 동작과 같은 행동의 변화가 관찰되었습니다.
진드기 타액으로 처리 된 물고기에서 알레르기 반응의 현저한 발생률이 관찰되어 급속한 탈감작과 내성을 나타냈다. 행동 변화는 알파 갈보다 진드기 타액으로 처리 된 물고기에서 더 두드러졌습니다. 대표적인 면역 마커의 발현에 대한 추가 분석은 RT-PCR에 의해 수행하였다.
결과는 신장의 제브라피쉬 그룹 간의 차이를 보여주었는데, 대조군에 비해 타액과 알파-갈을 처리한 어류에서 면역 반응 마커가 하향 조절되었습니다. 또한, 타액과 알파-갈로 처리된 제브라피쉬는 PBS로 처리된 어류보다 더 높은 수준을 보인 알파-갈에 대한 IgM 항체를 생성했습니다. 치료의 주입, 알레르기 반응 및 행동의 평가, 알레르기 반응으로 인한 죽은 물고기의 수 보고는 프로토콜의 가장 중요한 측면입니다.
진드기 타액에 대한 반응을 특성화하기 위해 mRNA, 단백질 및 마이크로바이옴 수준에서 오믹스 기술을 사용하면 이 과정에 관여하는 주요 생체 분자를 식별할 수 있습니다.
