Вопрос в том, почему только у некоторых особей, подвергшихся укусам клещей, развиваются аллергические реакции. Для нас выяснение биомолекул в слюне клещей и иммунных механизмов, связанных с этим процессом, является ключом к решению этого вопроса. Животная модель синдрома альфа-Гала у рыбок данио-рерио воспроизводит поведенческие паттерны человека и аллергические реакции в ответ на слюну клеща.
Этот экспериментальный подход способствует пониманию молекулярного взаимодействия клеща и хозяина, в котором у нас есть конфликт, связанный с синдромом альфа-Гала, и сотрудничество, связанное с реакцией антител на альфа-гал, которые защищают от патогенной инфекции. Чтобы обработать рыбу слюной клеща, разделите взрослых рыбок данио-рерио на три гендерно-сбалансированные группы. Используйте коммерческий Gala1-3Gal-BSA 3 или альфа-Gal в качестве положительного контроля и PBS в качестве отрицательного контроля.
Для извлечения слюны используйте полунабухших, не содержащих патогенов самок клещей, которых кормили в течение шести-семи дней на морских свинках. Обработайте клеща пятью микролитрами 2%-ного раствора пилокарпина гидрохлорида в PBS при рН 7,4 в гемоцель с помощью 50-микролитрового шприца с 0,33-миллиметровой иглой. Соберите слюну из гипостомы клеща с помощью 10-микролитрового наконечника, установленного на микропипетке.
Поместите слюну в 1,5-миллилитровую пробирку на льду и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Определите концентрацию белка в слюне, чтобы установить количество белка, которое будет введено рыбе, с помощью набора для анализа белка BCA, следуя рекомендациям производителя. Поддерживайте рыбок данио-рерио в проточной водной системе при температуре 27 градусов по Цельсию с циклом света-темноты от 14 до 10 часов.
Далее отбираем для инъекций 10 рыб в группу с аналогичным соотношением самок и самцов и схожим весом. Ненадолго обезболите рыбу, погрузив ее в 0,02% метансульфонат трикаина. Осторожно положите анестезированную рыбу на половину с помощью щипцов или рук на влажную губку с хвостовым плавником с правой стороны, чтобы вводить соединения в том же направлении, чтобы контролировать поражения.
Вводите группы рыб внутрикожно в мышцы с помощью шприца объемом 100 микролитров, оснащенного односантиметровой иглой 29-го калибра на расстоянии пяти миллиметров от хвостового плавника и под углом 45 градусов к телу рыбы. После инъекции поместите обработанную рыбу обратно в пресноводный резервуар без анестезии для восстановления. Кормите рыб два раза в день в 9:30 утра.
и 13:30 с 50-70 микрограммами сухого корма для рыб на рыбу до второго дня. Затем разомните корм для собак ступкой и пестиком, чтобы кормить рыб со второго дня после лечебной инъекции до конца эксперимента на восьмой день.
Для взятия проб закрепите усыпленную рыбу на парафиновой пластине булавками. Соберите сыворотку из жаберных кровеносных сосудов рыбы, когда жабры все еще орошаются кровью, с помощью шприца объемом 0,5 миллилитра, оснащенного иглой 29-го калибра длиной в один сантиметр. Храните собранную сыворотку в 1,5-миллилитровой пробирке при температуре 20 градусов Цельсия до использования.
Разрежьте рыбу стрельчатым лезвием скальпеля и оцените внутренние повреждения. Затем соберите кишечник и почки каждой рыбы в отдельные 1,5-миллилитровые пробирки. Извлеките общую РНК из кишечника и почек с помощью набора для очистки РНК.
Проанализируйте экспрессию генов, связанных с иммунным ответом, выполнив количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией или ОТ-кПЦР с использованием смеси обратной транскрипции для ОТ-кПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Нормализуйте значения мРНК cT по отношению к GAPDH рыбок данио-рерио и сравните группы с помощью t-критерия Стьюдента с неравной дисперсией. Определите титры антител IgM, которые распознают альфа-Gal в образцах сыворотки с помощью ИФА.
Запишите титры антител в виде значений оптической плотности 450 нанометров с помощью считывателя планшетов и сравните группы с помощью t-критерия Стьюдента с неравной дисперсией. Эта модель рыбок данио-рерио позволяет охарактеризовать и оценить различные аллергические реакции, связанные с реакцией хозяина на слюну клеща и их влиянием на синдром альфа-Гала или AGS. Кроме того, по сравнению с контрольной рыбой, у рыб, обработанных слюной клещей, наблюдались изменения в поведении, такие как медленное плавание, лежание на дне аквариума и отказ от еды, вибрация или зигзагообразное движение.
Значительная частота аллергических реакций наблюдалась у рыб, получавших слюну клещей, демонстрируя быструю десенсибилизацию и толерантность. Поведенческие изменения были более выражены у рыб, получавших слюну клещей, чем только альфа-гал. Дополнительный анализ экспрессии репрезентативных иммунных маркеров проводили методом ОТ-ПЦР.
Результаты показали различия между группами рыбок данио-рерио в почках, где маркеры иммунного ответа были подавлены у рыб, получавших слюну и альфа-Gal, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у рыбок данио, получавших слюну и альфа-гал, вырабатывались антитела IgM против альфа-Gal, которые показали более высокие уровни, чем у рыб, получавших PBS. Инъекция лечения, оценка аллергических реакций и поведения, а также сообщение о количестве мертвой рыбы от аллергических реакций являются наиболее важным аспектом протокола.
Использование омиксных технологий на уровне мРНК, белка, а также микробиома для характеристики реакции на слюну клеща позволяет идентифицировать ключевые биомолекулы, участвующие в этом процессе.
