A questão é por que apenas alguns indivíduos expostos a picadas de carrapatos desenvolvem reações alérgicas. Para nós, elucidar as biomoléculas presentes na saliva do carrapato e os mecanismos imunológicos que envolvem esse processo é fundamental para resolver essa questão. O modelo animal da síndrome alfa-Gal reproduz padrões comportamentais humanos e reações alérgicas em resposta à saliva do carrapato.
Esta abordagem experimental avança na compreensão da interação molecular carrapato-hospedeiro na qual temos conflito associado com a síndrome alfa-Gal e cooperação associada com a resposta de anticorpos para alfa-Gal, que são protetores contra a infecção por patógenos. Para tratar os peixes com saliva de carrapato, distribua peixes-zebra adultos em três grupos equilibrados em termos de gênero. Use Gala1-3Gal-BSA 3 ou alfa-Gal comercial como controle positivo e PBS como controle negativo.
Para a extração de saliva, utilizar carrapatos fêmeas semi-ingurgitadas, livres de patógenos, alimentadas por seis a sete dias em cobaias. Trate o carrapato com cinco microlitros de uma solução a 2% de cloridrato de pilocarpina em PBS a pH 7,4 no hemocoel usando uma seringa de 50 microlitros com uma agulha de 0,33 milímetros. Coletar saliva do carrapato hipostomo usando uma ponta de 10 microlitros montada em uma micropipeta.
Coloque a saliva em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo e armazene-a a 80 graus Celsius negativos. Determinar a concentração de proteína da saliva para estabelecer a quantidade de proteína a ser injetada no peixe usando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as recomendações do fabricante. Mantenha o peixe-zebra em um sistema de água de fluxo a 27 graus Celsius com um ciclo claro-escuro de 14 a 10 horas.
Em seguida, selecione 10 peixes por grupo com uma proporção semelhante de fêmeas para machos e peso semelhante para injeção. Anestesiar brevemente os peixes por imersão em metanossulfonato de tricaína a 0,02%. Colocar o peixe anestesiado em sua metade lateral, utilizando pinça ou mãos, cuidadosamente, sobre uma esponja molhada, com a nadadeira caudal do lado direito para injetar os compostos na mesma direção para controlar as lesões.
Injetar grupos de peixes por via intradérmica no músculo com uma seringa de 100 microlitros equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29 a cinco milímetros para a nadadeira caudal e um ângulo de 45 graus para o corpo do peixe. Após a injeção, coloque o peixe tratado de volta em um tanque de água doce sem anestesia para recuperação. Alimente os peixes duas vezes ao dia às 9h30.
e 13h30 com 50 a 70 microgramas de ração seca por peixe até o segundo dia. Em seguida, amasse a ração do cão com uma argamassa e pilão para alimentar os peixes do segundo dia após a injeção do tratamento até o final do experimento no oitavo dia.
Para a coleta das amostras, fixar os peixes eutanasiados em uma placa de parafina com pinos. Coletar o soro dos vasos sanguíneos branquiais dos peixes quando as brânquias ainda estiverem irrigadas com sangue usando uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29. Armazenar o soro coletado em um tubo de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius até o uso.
Cortar o peixe sagitalmente com uma lâmina de bisturi e avaliar as lesões internas. Em seguida, colete o intestino e o rim de cada peixe em tubos separados de 1,5 mililitro. Extraia o RNA total do intestino e do rim usando um kit de purificação de RNA.
Analisar a expressão de genes relacionados à resposta imune, realizando transcrição reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase, ou RT-qPCR utilizando uma mistura de transcrição reversa para RT-qPCR, de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar os valores de cT de mRNA contra o GAPDH do peixe-zebra e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Determinar títulos de anticorpos IgM que reconhecem alfa-Gal em amostras de soro por ELISA.
Registrar os títulos de anticorpos como valores de densidade óptica de 450 nanômetros usando um leitor de placas e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Este modelo de zebrafish permite a caracterização e avaliação de várias reações alérgicas devido à resposta do hospedeiro à saliva do carrapato e sua implicação na síndrome alfa-Gal, ou AGS. Além disso, em comparação com os peixes controle, alterações em comportamentos como nadar lentamente, deitar no fundo do tanque e não comer, vibrar ou ziguezaguear foram observadas em peixes tratados com saliva de carrapato.
Uma incidência significativa de reações alérgicas foi observada em peixes tratados com saliva de carrapato, mostrando rápida dessensibilização e tolerância. A mudança comportamental foi mais pronunciada nos peixes tratados com saliva de carrapato do que apenas com alfa-Gal. Análise adicional da expressão dos marcadores imunes representativos foi realizada por RT-PCR.
Os resultados mostraram diferenças entre os grupos de peixe-zebra no rim, onde os marcadores de resposta imune foram regulados negativamente em peixes tratados com saliva e alfa-Gal em comparação com o grupo controle. Além disso, os peixes-zebra tratados com saliva e alfa-Gal desenvolveram anticorpos IgM contra alfa-Gal que mostraram níveis mais altos do que em peixes tratados com PBS. A injeção do tratamento, a avaliação das reações alérgicas e do comportamento e o relato do número de peixes mortos por reações alérgicas são os aspectos mais importantes do protocolo.
O uso de tecnologias ômicas nos níveis de mRNA, proteína e também microbioma para caracterizar a resposta à saliva do carrapato permite identificar as principais biomoléculas envolvidas nesse processo.
