השאלה היא מדוע רק חלק מהאנשים שנחשפו לעקיצות קרציות מפתחים תגובות אלרגיות. עבורנו, הבהרת הביומולקולות ברוק הקרציות והמנגנונים החיסוניים המעורבים בתהליך זה היא המפתח להתמודדות עם שאלה זו. מודל בעלי החיים של דגי הזברה של תסמונת אלפא-גל משחזר דפוסי התנהגות אנושיים ותגובות אלרגיות בתגובה לרוק הקרציות.
גישה ניסיונית זו מקדמת את הבנת האינטראקציה המולקולרית בין קרציות לפונדקאי שבה יש לנו קונפליקט הקשור לתסמונת אלפא-גל ושיתוף פעולה הקשור לתגובת נוגדנים לאלפא-גל, המגנים מפני זיהום פתוגן. כדי לטפל בדגים ברוק קרציות, פזרו דגי זברה בוגרים לשלוש קבוצות מאוזנות מגדרית. השתמש ב- Gala1-3Gal-BSA 3 מסחרי או ב- alpha-Gal כבקרה חיובית וב- PBS כבקרה שלילית.
למיצוי רוק, השתמשו בקרציות נקבות חצי חרוכות, נטולות פתוגנים, המוזנות במשך שישה עד שבעה ימים בשרקנים. טפל בקרצייה עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסה 2% של פילוקרפין הידרוכלוריד ב- PBS ב- pH 7.4 לתוך ההמוקול באמצעות מזרק 50 מיקרוליטר עם מחט 0.33 מילימטר. אספו רוק מהיפוסטום הקרצייה באמצעות קצה של 10 מיקרוליטר המורכב על מיקרופיפטה.
מניחים את הרוק בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח, ומאחסנים אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לקבוע את ריכוז חלבון הרוק כדי לקבוע את כמות החלבון שיש להזריק לדגים באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, בהתאם להמלצות היצרן. שמרו על דגי זברה במערכת מים זורמים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס עם מחזור בהיר-כהה של 14 עד 10 שעות.
לאחר מכן, בחר 10 דגים לכל קבוצה עם יחס דומה של נקבות לזכרים ומשקל דומה להזרקה. מרדימים את הדג לזמן קצר על ידי טבילה ב-0.02% טריקאין מתאן-סולפונט. הניחו את הדג המורדם על חצי צידו בעזרת מלקחיים או ידיים בזהירות, על ספוג רטוב, כאשר הסנפיר הקאודלי בצד ימין כדי להזריק את התרכובות באותו כיוון כדי לשלוט בנגעים.
הזריקו קבוצות דגים תוך עורית לשריר באמצעות מזרק 100 מיקרוליטר המצויד במחט של סנטימטר אחד, 29 מד בחמישה מילימטרים לסנפיר הקאודלי ובזווית של 45 מעלות לגוף הדג. לאחר ההזרקה, החזירו את הדגים המטופלים למיכל מים מתוקים ללא הרדמה לצורך התאוששות. האכילו את הדגים פעמיים ביום בשעה 9:30 בבוקר.
ו-13:30 עם 50 עד 70 מיקרוגרם מזון דגים יבשים לכל דג עד היום השני. לאחר מכן מועכים את מזון הכלב עם מכתש ומזיק כדי להאכיל את הדגים מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי ביום השמיני.
לאיסוף דגימות, תקן את הדג המרדים על צלחת פרפין עם סיכות. אספו את הסרום מכלי הדם של הזימים של הדג כאשר הזימים עדיין מושקים בדם באמצעות מזרק 0.5 מיליליטר המצויד במחט של סנטימטר אחד, 29 מד. יש לאחסן את הסרום שנאסף בצינור של 1.5 מיליליטר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
חותכים את הדג עם להב אזמל, ולהעריך את הנגעים הפנימיים. לאחר מכן לאסוף את המעי והכליה של כל דג בצינורות נפרדים של 1.5 מיליליטר. חלצו את סך הרנ"א מהמעי ומהכליה באמצעות ערכת טיהור RNA.
לנתח את הביטוי של גנים הקשורים לתגובה חיסונית, ביצוע תגובת שרשרת כמותית של שעתוק לאחור-פולימראז, או RT-qPCR באמצעות תערובת שעתוק לאחור עבור RT-qPCR, על פי הוראות היצרן. נרמלו את ערכי cT mRNA כנגד GAPDH של דגי זברה, והשוו בין קבוצות באמצעות מבחן t של סטודנט עם שונות לא שווה. קביעת טיטרים נוגדנים IgM המזהים אלפא-גל בדגימות סרום על ידי ELISA.
רשום את טיטרי הנוגדנים כערכי צפיפות אופטית של 450 ננומטר באמצעות קורא לוחות, והשווה בין קבוצות באמצעות מבחן t סטודנט עם שונות לא שווה. מודל דג זברה זה מאפשר אפיון והערכה של תגובות אלרגיות שונות עקב תגובת המאכסן לרוק הקרציות והשלכותיהן בתסמונת אלפא-גל, או AGS. בנוסף, בהשוואה לדגי הביקורת, נצפו שינויים בהתנהגויות כגון שחייה איטית, שכיבה על קרקעית המיכל ואי אכילה, רטט או זיגזג בדגים שטופלו ברוק קרציות.
שכיחות משמעותית של תגובות אלרגיות נצפתה בדגים שטופלו ברוק קרציות, מה שהראה דה-סנסיטיזציה וסבילות מהירה. השינוי ההתנהגותי היה בולט יותר בדגים שטופלו ברוק קרציות מאשר רק באלפא-גל. ניתוח נוסף של ביטוי הסמנים החיסוניים המייצגים בוצע על ידי RT-PCR.
התוצאות הראו הבדלים בין קבוצות דגי זברה בכליה, שם סמני התגובה החיסונית היו מופחתים בדגים שטופלו ברוק ובאלפא-גל בהשוואה לקבוצת הביקורת. יתר על כן, דגי הזברה שטופלו ברוק ואלפא-גל פיתחו נוגדני IgM נגד אלפא-גל שהראו רמות גבוהות יותר מאשר בדגים שטופלו ב-PBS. הזרקת הטיפול, הערכת תגובות והתנהגות אלרגית ודיווח על מספר הדגים המתים מתגובות אלרגיות הם ההיבט החשוב ביותר בפרוטוקול.
שימוש בטכנולוגיות אומיקס ברמת ה-mRNA, החלבון וגם ברמת המיקרוביום כדי לאפיין את התגובה לרוק הקרציות מאפשר לנו לזהות את הביומולקולות העיקריות המעורבות בתהליך זה.
