La pregunta es por qué solo algunas personas expuestas a picaduras de garrapatas desarrollan reacciones alérgicas. Para nosotros, dilucidar las biomoléculas en la saliva de garrapatas y los mecanismos inmunes que involucran este proceso es clave para abordar esta pregunta. El modelo animal de pez cebra del síndrome alfa-Gal reproduce patrones de comportamiento humano y reacciones alérgicas en respuesta a la saliva de la garrapata.
Este enfoque experimental avanza en la comprensión de la interacción molecular garrapata-huésped en la que tenemos conflicto asociado con el síndrome alfa-Gal y la cooperación asociada con la respuesta de anticuerpos a alfa-Gal, que protegen contra la infección por patógenos. Para tratar a los peces con saliva de garrapata, distribuya el pez cebra adulto en tres grupos con equilibrio de género. Utilice Gala1-3Gal-BSA 3 comercial o alfa-Gal como control positivo y PBS como control negativo.
Para la extracción de saliva, use garrapatas hembras semi-hinchadas, libres de patógenos, alimentadas durante seis a siete días con conejillos de indias. Trate la garrapata con cinco microlitros de una solución al 2% de clorhidrato de pilocarpina en PBS a pH 7.4 en el hemocoel usando una jeringa de 50 microlitros con una aguja de 0.33 milímetros. Recoja saliva del hipostoma de garrapatas usando una punta de 10 microlitros montada en una micropipeta.
Coloque la saliva en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo y guárdela a menos 80 grados centígrados. Determine la concentración de proteína salival para establecer la cantidad de proteína que se inyectará en el pescado utilizando un kit de ensayo de proteína BCA, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Mantenga el pez cebra en un sistema de agua de flujo continuo a 27 grados centígrados con un ciclo de luz-oscuridad de 14 a 10 horas.
A continuación, seleccione 10 peces por grupo con una proporción similar de hembras a machos y un peso similar para la inyección. Anestesiar brevemente el pescado por inmersión en metanosulfonato de tricaína al 0,02%. Coloque el pez anestesiado en su mitad de lado usando fórceps o manos con cuidado, sobre una esponja húmeda, con la aleta caudal en el lado derecho para inyectar los compuestos en la misma dirección para controlar las lesiones.
Inyecte grupos de peces por vía intradérmica en el músculo con una jeringa de 100 microlitros equipada con una aguja de calibre 29 de un centímetro a cinco milímetros de la aleta caudal y un ángulo de 45 grados con respecto al cuerpo del pez. Después de la inyección, coloque el pescado tratado nuevamente en un tanque de agua dulce sin anestesia para su recuperación. Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m.
y 1:30 p.m. con 50 a 70 microgramos de alimento para peces secos por pez hasta el segundo día. Luego triture la comida para perros con un mortero para alimentar a los peces desde el segundo día después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento en el día ocho.
Para la recolección de muestras, fije el pescado sacrificado en una placa de parafina con alfileres. Recoja el suero de los vasos sanguíneos branquiales de los peces cuando las branquias todavía estén irrigadas con sangre utilizando una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 29 de un centímetro. Guarde el suero recolectado en un tubo de 1.5 mililitros a 20 grados centígrados hasta que lo use.
Corte el pescado sagitalmente con una cuchilla de bisturí y evalúe las lesiones internas. Luego recoja el intestino y el riñón de cada pez en tubos separados de 1.5 mililitros. Extraiga el ARN total del intestino y el riñón utilizando un kit de purificación de ARN.
Analizar la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune, realizando una reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa o RT-qPCR utilizando una mezcla de transcripción inversa para RT-qPCR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores de mRNA cT contra el pez cebra GAPDH, y comparar entre grupos utilizando una prueba t de Student con varianza desigual. Determinar los títulos de anticuerpos IgM que reconocen alfa-Gal en muestras de suero mediante ELISA.
Registre los títulos de anticuerpos como valores de densidad óptica de 450 nanómetros utilizando un lector de placas, y compare entre grupos utilizando una prueba t de Student con varianza desigual. Este modelo de pez cebra permite la caracterización y evaluación de diversas reacciones alérgicas debidas a la respuesta del huésped a la saliva de la garrapata y su implicación en el síndrome alfa-Gal, o AGS. Además, en comparación con el pez control, se observaron alteraciones en comportamientos como nadar lentamente, acostarse en el fondo del tanque y no comer, vibrar o zigzaguear en el movimiento en peces tratados con saliva de garrapata.
Se observó una incidencia significativa de reacciones alérgicas en peces tratados con saliva de garrapata, mostrando una rápida desensibilización y tolerancia. El cambio de comportamiento fue más pronunciado en los peces tratados con saliva de garrapatas que solo con alfa-Gal. El análisis adicional de la expresión de los marcadores inmunes representativos se realizó mediante RT-PCR.
Los resultados mostraron diferencias entre los grupos de pez cebra en el riñón, donde los marcadores de respuesta inmune se regularon negativamente en los peces tratados con saliva y alfa-Gal en comparación con el grupo de control. Además, el pez cebra tratado con saliva y alfa-Gal desarrolló anticuerpos IgM contra alfa-Gal que mostraron niveles más altos que en los peces tratados con PBS. La inyección del tratamiento, la evaluación de las reacciones alérgicas y el comportamiento, y el informe del número de peces muertos por reacciones alérgicas son el aspecto más importante del protocolo.
El uso de tecnologías ómicas a nivel de ARNm, proteína y microbioma para caracterizar la respuesta a la saliva de garrapatas nos permite identificar las biomoléculas clave involucradas en este proceso.
