والسؤال هو لماذا فقط بعض الأفراد المعرضين لدغات القراد تطوير الحساسية. بالنسبة لنا ، فإن توضيح الجزيئات الحيوية في لعاب القراد والآليات المناعية التي تنطوي على هذه العملية هو المفتاح لمعالجة هذا السؤال. يستنسخ النموذج الحيواني لسمك الزرد لمتلازمة ألفا غال الأنماط السلوكية البشرية وردود الفعل التحسسية استجابة لعاب القراد.
يعزز هذا النهج التجريبي فهم التفاعل الجزيئي بين القراد والمضيف الذي لدينا فيه تعارض مرتبط بمتلازمة ألفا غال والتعاون المرتبط باستجابة الأجسام المضادة لألفا غال ، والتي تحمي من عدوى مسببات الأمراض. لعلاج الأسماك بلعاب القراد ، قم بتوزيع الزرد البالغ إلى ثلاث مجموعات متوازنة بين الجنسين. استخدم Gala1-3Gal-BSA 3 التجاري أو alpha-Gal كعنصر تحكم إيجابي و PBS كعنصر تحكم سلبي.
لاستخراج اللعاب ، استخدم القراد الأنثوي شبه المحتقن والخالي من مسببات الأمراض الذي يتغذى لمدة ستة إلى سبعة أيام على خنازير غينيا. عالج القراد بخمسة ميكرولتر من محلول 2٪ من هيدروكلوريد بيلوكاربين في PBS عند درجة الحموضة 7.4 في الهيموكول باستخدام حقنة 50 ميكرولتر بإبرة 0.33 ملم. جمع اللعاب من hypostome القراد باستخدام طرف 10 ميكرولتر شنت على micropipette.
ضع اللعاب في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر على الثلج ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. حدد تركيز بروتين اللعاب لتحديد كمية البروتين المراد حقنها في الأسماك باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA ، باتباع توصيات الشركة المصنعة. حافظ على الزرد في نظام مائي متدفق عند 27 درجة مئوية مع دورة ضوء وظلام من 14 إلى 10 ساعات.
بعد ذلك ، حدد 10 أسماك لكل مجموعة مع نسبة مماثلة من الإناث إلى الذكور ووزن مماثل للحقن. تخدير الأسماك لفترة وجيزة عن طريق الغمر في 0.02٪ تريكايين ميثان سلفونات. ضع السمكة المخدرة على نصفها باستخدام ملقط أو يدين بعناية ، على إسفنجة مبللة ، مع الزعنفة الذيلية على الجانب الأيمن لحقن المركبات في نفس الاتجاه للسيطرة على الآفات.
حقن مجموعات من الأسماك داخل الأدمة في العضلات باستخدام حقنة سعة 100 ميكرولتر مزودة بإبرة طولها سنتيمتر واحد وقياس 29 عند خمسة ملليمترات إلى الزعنفة الذيلية وزاوية 45 درجة إلى جسم السمكة. بعد الحقن ، ضع الأسماك المعالجة مرة أخرى في خزان المياه العذبة دون تخدير للتعافي. أطعم السمك مرتين يوميا في الساعة 9:30 صباحا.
و 1:30 مساء مع 50 إلى 70 ميكروغرام من علف الأسماك الجافة لكل سمكة حتى اليوم الثاني. ثم يهرس طعام الكلاب بمدافع الهاون والمدقة لإطعام الأسماك من اليوم الثاني بعد حقن العلاج حتى نهاية التجربة في اليوم الثامن.
لجمع العينات ، ثبت السمك الرحيم على طبق البارافين مع دبابيس. اجمع المصل من الأوعية الدموية الخيشومية للأسماك عندما لا تزال الخياشيم مروية بالدم باستخدام حقنة سعة 0.5 ملليلتر مزودة بإبرة طولها سنتيمتر واحد وقياس 29. قم بتخزين المصل الذي تم جمعه في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر عند 20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
قطع السمك سهميا بشفرة مشرط ، وتقييم الآفات الداخلية. ثم اجمع أمعاء كل سمكة وكليتها في أنابيب منفصلة سعة 1.5 ملليلتر. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الأمعاء والكلى باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي.
تحليل التعبير عن الجينات المتعلقة بالاستجابة المناعية ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي ، أو RT-qPCR باستخدام مزيج النسخ العكسي ل RT-qPCR ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تطبيع قيم mRNA cT مقابل الزرد GAPDH ، والمقارنة بين المجموعات باستخدام اختبار t للطالب مع تباين غير متساو. تحديد عيار الأجسام المضادة IgM التي تتعرف على alpha-Gal في عينات المصل بواسطة ELISA.
سجل عيار الأجسام المضادة كقيم كثافة بصرية 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ، وقارن بين المجموعات باستخدام اختبار t للطلاب مع تباين غير متساو. يسمح نموذج الزرد هذا بتوصيف وتقييم ردود الفعل التحسسية المختلفة بسبب استجابة المضيف لعاب القراد وآثارها في متلازمة ألفا غال ، أو AGS. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الأسماك الضابطة ، لوحظت تغيرات في السلوكيات مثل السباحة البطيئة ، والاستلقاء على قاع الحوض ، وعدم تناول الطعام ، أو الاهتزاز أو الحركة المتعرجة في الأسماك المعالجة باللعاب القراد.
لوحظ حدوث كبير من الحساسية في الأسماك المعالجة بلعاب القراد ، مما يدل على إزالة الحساسية السريعة والتسامح. كان التغيير السلوكي أكثر وضوحا في الأسماك التي عولجت بلعاب القراد مقارنة بألفا غال فقط. تم إجراء تحليل إضافي للتعبير عن علامات المناعة التمثيلية بواسطة RT-PCR.
أظهرت النتائج اختلافات بين مجموعات الزرد في الكلى ، حيث تم تنظيم علامات الاستجابة المناعية في الأسماك المعالجة باللعاب وألفا غال مقارنة بالمجموعة الضابطة. علاوة على ذلك ، طورت أسماك الزرد المعالجة باللعاب وألفا غال أجساما مضادة IgM ضد alpha-Gal أظهرت مستويات أعلى من الأسماك المعالجة ب PBS. يعد حقن العلاج وتقييم ردود الفعل التحسسية والسلوك والإبلاغ عن عدد الأسماك الميتة من ردود الفعل التحسسية أهم جانب في البروتوكول.
يسمح لنا استخدام تقنيات omics في مستويات mRNA والبروتين والميكروبيوم لتوصيف الاستجابة لعاب القراد بتحديد الجزيئات الحيوية الرئيسية المشاركة في هذه العملية.
