Die Frage ist, warum nur einige Personen, die Zeckenstichen ausgesetzt sind, allergische Reaktionen entwickeln. Für uns ist die Aufklärung der Biomoleküle im Zeckenspeichel und der Immunmechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind, der Schlüssel zur Beantwortung dieser Frage. Das Zebrafisch-Tiermodell des Alpha-Gal-Syndroms reproduziert menschliche Verhaltensmuster und allergische Reaktionen als Reaktion auf Zeckenspeichel.
Dieser experimentelle Ansatz fördert das Verständnis der molekularen Zecken-Wirt-Interaktion, bei der wir Konflikte im Zusammenhang mit dem Alpha-Gal-Syndrom haben, und der Zusammenarbeit im Zusammenhang mit der Antikörperantwort auf Alpha-Gal, die vor einer Infektion mit Krankheitserregern schützen. Um den Fisch mit Zeckenspeichel zu behandeln, verteilen Sie erwachsene Zebrafische in drei geschlechtergerechte Gruppen. Verwenden Sie handelsübliche Gala1-3Gal-BSA 3 oder alpha-Gal als Positivkontrolle und PBS als Negativkontrolle.
Verwenden Sie für die Speichelextraktion halb angeschwollene, pathogenfreie, weibliche Zecken, die sechs bis sieben Tage lang an Meerschweinchen gefüttert werden. Behandeln Sie die Zecke mit fünf Mikrolitern einer 2%igen Lösung von Pilocarpinhydrochlorid in PBS bei pH 7,4 in das Hämocoel mit einer 50-Mikroliter-Spritze mit einer 0,33-Millimeter-Nadel. Sammeln Sie Speichel aus dem Zeckenhypostom mit einer 10-Mikroliter-Spitze, die auf einer Mikropipette montiert ist.
Legen Sie den Speichel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie die Speichelproteinkonzentration, um die Menge an Protein zu bestimmen, die dem Fisch injiziert werden soll, indem Sie ein BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden. Halten Sie Zebrafische in einem Durchflusswassersystem bei 27 Grad Celsius mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 bis 10 Stunden.
Als nächstes wählen Sie 10 Fische pro Gruppe mit einem ähnlichen Verhältnis von Weibchen zu Männchen und ähnlichem Gewicht für die Injektion aus. Betäuben Sie den Fisch kurzzeitig durch Eintauchen in 0,02% Tricainmethansulfonat. Legen Sie den betäubten Fisch mit einer Pinzette oder den Händen vorsichtig auf einen feuchten Schwamm, wobei sich die Schwanzflosse auf der rechten Seite befindet, um die Verbindungen in die gleiche Richtung zu injizieren, um die Läsionen zu kontrollieren.
Injizieren Sie Gruppen von Fischen intradermal in den Muskel mit einer 100-Mikroliter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel von einem Zentimeter fünf Millimeter bis zur Schwanzflosse und einem 45-Grad-Winkel zum Körper des Fisches ausgestattet ist. Legen Sie den behandelten Fisch nach der Injektion zur Genesung ohne Betäubung wieder in ein Süßwasserbecken. Füttern Sie die Fische zweimal täglich um 9:30 Uhr.
und 13:30 Uhr mit 50 bis 70 Mikrogramm Trockenfutter pro Fisch bis zum zweiten Tag. Dann zerdrücken Sie das Hundefutter mit einem Mörser und Stößel, um die Fische vom zweiten Tag nach der Behandlungsinjektion bis zum Ende des Experiments am achten Tag zu füttern.
Befestigen Sie den eingeschläferten Fisch zur Probenentnahme mit Stiften auf einer Paraffinplatte. Sammeln Sie das Serum aus den Kiemenblutgefäßen des Fisches, wenn die Kiemen noch mit Blut gespült sind, mit einer 0,5-Milliliter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel von einem Zentimeter ausgestattet ist. Bewahren Sie das gesammelte Serum bis zur Verwendung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 20 Grad Celsius auf.
Schneiden Sie den Fisch sagittal mit einer Skalpellklinge und beurteilen Sie die inneren Läsionen. Sammeln Sie dann den Darm und die Niere jedes Fisches in separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus dem Darm und der Niere mit einem RNA-Aufreinigungskit.
Analysieren Sie die Expression von Genen, die mit der Immunantwort zusammenhängen, und führen Sie eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion oder RT-qPCR unter Verwendung einer reversen Transkriptionsmischung für RT-qPCR gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Normalisieren Sie die mRNA-cT-Werte gegen Zebrafisch-GAPDH und vergleichen Sie die Gruppen mit einem Student-t-Test mit ungleicher Varianz. Bestimmen Sie IgM-Antikörpertiter, die Alpha-Gal in Serumproben durch ELISA erkennen.
Zeichnen Sie die Antikörpertiter mit einem Plattenleser als optische Dichtewerte von 450 Nanometern auf und vergleichen Sie die Gruppen mit einem Student-t-Test mit ungleicher Varianz. Dieses Zebrafischmodell ermöglicht die Charakterisierung und Bewertung verschiedener allergischer Reaktionen aufgrund der Reaktion des Wirts auf Zeckenspeichel und deren Auswirkungen auf das Alpha-Gal-Syndrom (AGS). Darüber hinaus wurden im Vergleich zu den Kontrollfischen bei mit Zeckenspeichel behandelten Fischen Verhaltensänderungen wie langsames Schwimmen, Liegen auf dem Boden des Beckens und Nichtfressen, Vibrieren oder Zickzackbewegungen beobachtet.
Bei Fischen, die mit Zeckenspeichel behandelt wurden, wurde eine signifikante Inzidenz allergischer Reaktionen beobachtet, die eine schnelle Desensibilisierung und Toleranz zeigten. Die Verhaltensänderung war bei den Fischen, die mit Zeckenspeichel behandelt wurden, stärker ausgeprägt als bei Alpha-Gal. Eine zusätzliche Analyse der Expression der repräsentativen Immunmarker wurde mittels RT-PCR durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten Unterschiede zwischen Zebrafischgruppen in der Niere, wo die Immunantwortmarker bei Fischen, die mit Speichel und Alpha-Gal behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe herunterreguliert wurden. Darüber hinaus entwickelten die Zebrafische, die mit Speichel und Alpha-Gal behandelt wurden, IgM-Antikörper gegen Alpha-Gal, die höhere Konzentrationen aufwiesen als bei Fischen, die mit PBS behandelt wurden. Die Injektion der Behandlung, die Bewertung allergischer Reaktionen und Verhaltensweisen sowie die Meldung der Anzahl der toten Fische aufgrund allergischer Reaktionen sind der wichtigste Aspekt des Protokolls.
Der Einsatz von Omics-Technologien auf mRNA-, Protein- und auch Mikrobiomebene zur Charakterisierung der Reaktion auf Zeckenspeichel ermöglicht es uns, die wichtigsten Biomoleküle zu identifizieren, die an diesem Prozess beteiligt sind.
