体外 使用纯化的重组 果蝇 半胱天冬酶进行底物筛选的切割测定

半胱天冬酶是在细胞凋亡和非凋亡过程中裂解底物的半胱氨酸蛋白酶。该协议描述了一种体外切割测定，以鉴定来自果蝇的引发剂半胱天冬Dronc的推定底物。如果仔细遵循，该协议为半胱天冬酶Dronc或任何其他半胱天冬酶的推定底物的高通量筛选提供了可靠的程序。

虽然该协议已被设计用于使用果蝇半胱天冬酶Dronc的体外切割测定，但它可以很容易地适用于其他生物体（包括哺乳动物）的半胱天冬酶。重要的是，重组半胱天冬酶的纯化和体外切割测定在同一天进行，因为这些半胱天冬酶制剂会迅速失去酶活性。演示该程序的将是我实验室的博士后研究员Prathibha Yarikipati博士。

首先，从零下80摄氏度的储存中取出装有颗粒培养物的冷冻管，并将它们放在冰上10分钟以软化沉淀。10分钟后，使用带有1毫升血清移液管的移液器控制器将0.6毫升补充有新添加的蛋白酶抑制剂，10毫克/毫升溶菌酶和50单位/毫升Benzonase的细菌细胞裂解缓冲液加入含有沉淀的试管中。使用相同的移液器吸头，通过上下移液溶解沉淀，直到可见没有任何颗粒的透明淡黄色溶液，并在冰上孵育 30 分钟。

将裂解物转移到适当的离心管中，并在4摄氏度下以17， 000 G离心40分钟。将上清液转移到1.5毫升微量离心管中，这是含有半胱天冬酶的粗提取物，并将管保持在冰上。向半胱天冬酶提取物的每个试管中加入0.2毫升50%的Ni-硝基乙酸琼脂糖浆液，并在4摄氏度下在端到端旋转器上旋转试管一小时。

一小时后，将带有Ni-硝基乙酸琼脂糖的提取物加入一毫升聚丙烯柱中，尖端完好无损，置于架子中，静置五分钟，让Ni-硝基乙酸琼脂糖沉淀。五分钟后，取下柱盖，让上清液通过重力流出。然后小心地向色谱柱中加入一毫升洗涤缓冲液，不要干扰Ni-次氮乙酸琼脂糖的包装树脂，并通过重力流洗涤。

为了洗脱半胱天冬酶，在完全排出洗涤缓冲液后，将1.5毫升微量离心管置于色谱柱的收集喷嘴下方。然后，向每根色谱柱中加入0.5毫升洗脱缓冲液，并将洗脱液收集在1.5毫升微量离心管中。将洗脱液保持在冰上，并通过布拉德福德测定法测量蛋白质的浓度。

根据推定底物的表达水平，使用1至10微升兔网织红细胞裂解物，该裂解物在切割测定中用感兴趣的蛋白质编程，并将其保持在冰上。加入先前产生的10微克纯化的半胱天冬酶蛋白，并用半胱天冬酶测定缓冲液使总反应体积达到50微升。将反应在30摄氏度的水浴中孵育3小时，确保在切割测定中包括适当的对照。

三小时后，通过将试管转移到冰上来停止反应，并加入含有50毫摩尔DTT的LDS样品缓冲液。将样品在 75 摄氏度的加热块中孵育 10 分钟。快速旋转，轻弹混合，每个样品加载 24 微升，然后运行 SDS 页面或将样品储存在零下 20 摄氏度。

通过SDS-PAGE诱导、纯化和分析四种不同的重组半胱天冬酶，免疫印迹，并用抗组氨酸抗体探测印迹。未加工的6x-组氨酸Dronc以55千道尔顿的相对分子量运行，未加工的6x-His DRIC的分子量为35千道尔顿。半胱天冬酶的自动处理通过较小分子量的条带的外观可见。

对于劈开的Dronc，它是一个40千道尔顿的带。对于劈开的Drice，它是一个23千道尔顿的带。体外切割反应后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，免疫印迹，并将印迹与抗Myc抗体孵育以检测氨基末端Myc标记的Drice C211A。

结果表明，细菌产生纯化的6x-组氨酸Dronc野生型制剂具有酶活性。与未切割的proDrice相比，这可以通过存在较小的裂解Drice带来证明。使用重组半胱天冬酶和底物的体外切割反应通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。

为了分析切割反应，在该免疫印迹中使用了抗裂解的Drice抗体。结果表明，细菌产生和纯化的6x-His Dronc制剂具有酶活性。与未切割的ProDrice相比，通过存在较小的裂解Drice带可以看出这一点。

请记住，重组半胱天冬酶会迅速失去酶活性。它们不能储存，即使在零下 80 摄氏度下也不能储存。体外切割测定必须在同一天进行。

体外切割测定中的阳性命中应在体内验证。这可以在细胞或遗传模型生物（如果蝇或秀丽隐杆线虫）中完成。