鉴定甲型流感病毒感染期间切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序

该方法将有助于确定和确认流感病毒感染细胞中的蛋白质是否经历半胱天冬酶的降解或切割，并鉴定半胱天冬酶切割位点。这种方法只需要基本的分子和细胞生物学实验室设置和研究技能，不需要任何专门的设备或软件培训。这种方法可以适应于实现类似的目标，包括感染其他动物病毒或微生物，以及暴露于外部刺激，如毒素和化学物质。

首先，将MDCK或A549细胞接种在12孔细胞培养板中。将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳气氛下孵育过夜。第二天，从细胞中取出旧培养基，并用一毫升无血清MEM洗涤每个孔中的细胞两次。

然后，通过加入400微升甲型流感病毒接种物来感染细胞，并将板放置孵育一小时。孵育后，取出病毒接种物并用MEM洗涤细胞。向每个孔中加入一毫升无血清MEM，并如上一步所示孵育细胞。

24小时后，用一毫升注射器柱塞刮取细胞，并将其转移到1.5毫升管中。将试管在室温下以12， 000G离心两分钟，收集上清液。用250微升磷酸盐缓冲盐水和离心机洗涤细胞沉淀。

除去上清液并加入100微升细胞裂解缓冲液。涡旋混合。将试管在 98 摄氏度下加热 10 分钟以完全裂解细胞。

然后，通过标准SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未感染和感染样品中等量的蛋白质。电泳后，将蛋白质凝胶转移到硝酸纤维素或PVDF膜上进行蛋白质印迹。比较模拟处理和抑制剂处理的感染样品泳道中的蛋白质水平。

在100微升适当的培养基（如Opti-MEM）中，稀释100纳摩尔的对照或半胱天冬酶siRNA，或适当体积的转染试剂。在室温下孵育五分钟。将 100 微升每种 siRNA 溶液与 100 微升转染试剂溶液混合，并在室温下孵育 20 至 45 分钟。

在800微升的完整生长培养基中分裂并加入100，000 MDCK或A549细胞。加入 200 μL siRNA 转染试剂复合物，并将该悬浮液加入 12 孔培养板中。将细胞在37摄氏度的5%二氧化碳气氛下孵育72小时。

用甲型流感病毒感染细胞，但没有抑制剂。进行蛋白质印迹，并比较如前所示的蛋白质水平。在多肽上找到半胱天冬酶切割基序XXXD和DXXD。

通过定点诱变使 P1 天冬氨酸、两种谷氨酸或丙氨酸发生突变，并通过 DNA 测序进行确认。在100微升适当的培养基中，稀释两微克野生型或突变型血浆DNA或推荐体积的转染试剂，并在室温下孵育试管5分钟。将 100 微升血浆 DNA 溶液与 100 微升转染试剂溶液混合，并在室温下孵育 20 至 45 分钟。

同时，分裂并将300，000个MDCK或A549细胞加入到800微升完全生长培养基中。加入200微升DNA转染试剂复合物，并将该悬浮液加入12孔培养板中。将板在37%二氧化碳气氛下在5%的气氛下孵育。

48小时后，用不含抑制剂的甲型流感病毒感染细胞。进行蛋白质印迹，并比较如前所示的蛋白质水平。使用蛋白质印迹法，评估流感诱导的宿主半胱天冬酶对宿主皮质肌动蛋白的降解。

用半胱天冬酶-3抑制剂治疗流感病毒感染细胞导致皮质肌动蛋白的挽救和病毒NP降解。皮质肌动蛋白条带强度的定量及其与相应肌动蛋白带的标准化表明，与未处理的感染细胞相比，半胱天冬酶-3抑制剂处理的感染细胞中的皮质肌动蛋白水平更高。在半胱天冬酶-6或半胱天冬酶-7耗尽的细胞中。

没有观察到皮质肌动蛋白多肽水平的显着恢复，而在半胱天冬酶-3耗尽的细胞中，从流感病毒中恢复的皮质肌动蛋白诱导降解。多肽水平的定量和比较表明，半胱天冬酶-3表达耗尽的感染细胞中的皮质肌动蛋白多肽水平高于半胱天冬酶-3表达正常的细胞。位置116处的天冬氨酸突变为谷氨酸，使皮质肌动蛋白多肽对流感病毒诱导的降解具有抗性。

多肽水平的定量和比较表明，感染细胞中突变型皮质肌动蛋白多肽的水平高于野生型皮质肌动蛋白多肽。需要产生数十个突变体并进行重复蛋白质印迹以鉴定多肽中的半胱天冬酶切割位点。可以开发一种含有纯化的半胱天冬酶和靶多肽的体外生化测定，以确认感兴趣的蛋白质是直接的基于气体的底物。

该协议将有助于了解正在研究的系统中靶蛋白的重要性，降解或切割，例如病毒感染或疾病。