早期的眼部研究主要依赖于已故个体的眼部组织。然而，多年来，已经开发了许多眼科啮齿动物模型，对人类眼组织的需求已经减少。由于啮齿动物眼睛的体积小且手术面积有限，因此有效进入眼部亚部分受到严重限制。
通常，要对啮齿动物的眼睛进行手术，需要通过视神经固定眼睛并进行解剖。这种做法很艰巨，并且随着球眼在解剖过程中继续移动，可能会损坏脆弱的组织。尽管有利于隔离视网膜层的各个部分，但该技术在解剖组织时无法划分组织的空间方向。
此外，由于后眼杯和前眼杯的细胞组装均匀，因此难以在解剖后找到有针对性的干预。在本视频中，展示了一种改进的显微切割手术方法。附着的螨膜或第三眼睑的存在具有独特而显着的优势。
在这种方法中，首先用第三眼睑去眼球眼球，然后使用第三眼睑固定眼睛。然后通过角膜缘刺穿眼球，并将切口用作切口。然后，通过沿圆周切割，将前眼杯和后眼杯分开。
通过进一步解剖后眼杯，识别并轻轻剥离神经视网膜的半透明层。因此获得神经层和RPE层以进行进一步处理。第三个眼睑将使我们能够划定眼球摘除后的空间方向。
现在让我们按照详细的分步过程进行操作。使用滴0.8%托吡卡胺和5%去氧肾上腺素眼用溶液扩张啮齿动物的眼睛，并在手术前将动物置于黑暗区域30分钟。通过腹膜内施用五倍剂量的麻醉对动物实施安乐死。
典型剂量为200微升PBS，含有10mg氯胺酮和1mg甲苯噻嗪。通过检查踏板反射来确认对刺激完全缺乏反应。将鼠标放在侧面卧位以允许完全进入眼睛。
准备好 Colibri 缝合钳、弯曲镊子、15 度三毫米尺寸的微刀片、弹簧微型剪刀和倾斜的弹簧微型剪刀。在眼球周围放置一个弯曲的镊子并捏住以使眼睛摆脱无关的附件。第三眼睑，也称为鼻膜，位于鼻切线的上角，可以识别为具有色素边界的轻微半透明突起。
接下来，使用弹簧微型剪刀在眼球周围剪开。小而连续的切口将眼球从巩膜附件中释放出来。在眼球下方放置一把弯曲的弹簧微型剪刀，通过切割视神经来解放眼睛。
将去核的眼睛放在含有PBS缓冲液的培养皿中，使眼球浸没在PBS中。一些眼外肌肉或组织将开始从眼球上漂浮。使用弹簧微型剪刀将它们从眼球上剪下来，将其取下。
然后，从眼球底部移除视神经，以便更好地分离视网膜以进行整体安装准备。没有必要切除视神经进行组织切片。将眼球转移到含有一ml 4%多聚甲醛或PFA的1.5ml管中。
在四摄氏度下保持两个小时以进行组织固定。通过将组织在PFA中在4摄氏度下放置长达12小时，可以在此步骤中暂停。然而，对于活细胞的分离，不应进行固定步骤，整个过程需要连续进行。
PFA固定后，将眼球转移到含有PBS的培养皿中，并将其置于解剖显微镜下以执行后续程序。用 Colibri 缝合镊子牢牢按住第三眼睑来固定眼球。角膜缘是角膜巩膜连接处。
使用微刀片刺穿角膜缘，在角膜缘处做一个小切口。切口最好与第三眼睑相对。接下来，以这个切口为起点，用微型剪刀沿着这个角膜巩膜巩膜缘周长做小而连续的切口。
首先，完成从切口点到第三眼睑的半圆切口。然后在另一侧完成剩余的半圆切割。最后，在第三眼睑周围切开，将后杯和前杯分开。
使用镊子从后杯上取下晶状体，以获得由神经视网膜和RPE层组成的后杯以及角膜前杯。如果使用未固定的组织，现在可以酶消化前杯和后杯以获得角膜或视网膜单细胞悬液。为了固定组织，将这些杯子转移到含有1ml 4%PFA的1.5ml管中，在4摄氏度下放置12小时。
固定后，可以将组织包埋在适当的培养基中，并且可以进行冷冻切片或石蜡切片以获得角膜或视网膜切片。将后杯重新引入含有PBS缓冲液的培养皿中。色素性RPE层上的不透明层是神经视网膜。
使用第二个镊子剥离神经视网膜。强烈建议非常轻柔和轻微的手部移动，以免损坏组织。在视神经出口处，可以将弯曲的弹簧剪刀插入神经视网膜下方，如果神经视网膜仍然附着，则可以进行切割以完全释放层。
视网膜也可以通过用软刷轻轻抚摸来释放或分离。将前杯和后杯重新引入含有PBS缓冲液的培养皿中。使用倾斜的弹簧微型剪刀在第三眼睑旁边从周边垂直于光学中心切开。
保持第三眼睑的抓地力，并在第一个切口旁边做一个切口。在第二个切口和第三个眼睑之间做一个类似的切口。三到四个这样的等距切口将半球形杯子打开成花形，平坦且易于安装。
在杯子中心之前不要做很深的切口，因为这可能会使叶子部分容易散开或分离。液体培养基允许前眼杯获得弯曲结构。按照与在后杯上进行切口相同的步骤，在前杯上进行三到四个等距切口。
组织现在已准备好进行进一步染色。在此图中，显示了前杯的整体安装。如上所述对角膜组织进行显微解剖，以揭示角膜小叶附着结膜组织中的淋巴管。
在此图中，显示了神经视网膜的整体安装。神经视网膜的视网膜脉管系统用异凝集素染色，可见为绿色血管。在该方法中，用附着的第三眼睑获得小鼠的去核眼球，以便有效且易于处理。
第三眼睑完全固定眼球，并允许解剖轻松进行，误差最小。该方法有利于眼组织特异性切片、单细胞分析和整体切片。然而，对重复组织固定的需求使得组织无法用于细胞培养或此类活细胞必需品。
因此，该程序需要连续进行活细胞分离。
