Daha önceki zamanlarda yapılan oküler araştırmalar çoğunlukla ölen bireylerin oküler dokusuna dayanıyordu. Bununla birlikte, yıllar geçtikçe, birçok oftalmik kemirgen modeli geliştirilmiş ve insan oküler dokusuna olan ihtiyaç azalmıştır. Kemirgen gözündeki küçük boyut ve sınırlı operasyon alanı nedeniyle, oküler alt parçalara etkili erişim ciddi şekilde kısıtlanmıştır.
Tipik olarak, bir kemirgenin gözü üzerinde çalışmak için, göz optik sinir yoluyla hareketsiz hale getirilir ve diseksiyon yapılır. Bu uygulama zordur ve diseksiyon sırasında küresel göz hareket etmeye devam ettiği için kırılgan dokuya zarar verebilir. Retina tabakalarının çeşitli bölümlerinin izole edilmesinde faydalı olmasına rağmen, bu teknik dokunun diseksiyonu üzerine dokunun mekansal yönelimini belirleyemez.
Ayrıca, posterior ve anterior göz kapağının homojen hücresel montajı nedeniyle diseksiyon sonrası hedefe yönelik bir müdahalenin bulunması zordur. Bu videoda, mikrodiseksiyon için modifiye cerrahi bir yöntem gösterilmiştir. Bağlı niktitasyon zarının veya üçüncü göz kapağının varlığı, benzersiz ve önemli avantajlar sunar.
Bu yöntemde önce göz küresi üçüncü göz kapağı ile enüklee edilir, daha sonra gözü hareketsiz hale getirmek için üçüncü göz kapağı kullanılır. Bunu kornea limbusundan göz küresinin delinmesi izler ve kesi giriş noktası olarak kullanılır. Daha sonra, çevre boyunca kesilerek, ön ve arka göz kapakları ayrılır.
Arka göz kapağını daha da diseke ederek, nöral retinanın yarı saydam tabakası tanımlanır ve nazikçe soyulur. Nöral ve RPE katmanları böylece daha sonraki işlemler için elde edilir. Üçüncü göz kapağı, göz sonrası enükleasyonun uzamsal yönünü belirlememizi sağlayacaktır.
Şimdi ayrıntılı adım adım prosedürü takip edelim. Kemirgen gözlerini% 0.8 tropikamid% 5 fenilefrin oftalmik çözeltileri kullanarak genişletin ve hayvanı işlemden önce 30 dakika boyunca karanlık bir alana yerleştirin. İntraperitoneal olarak beş kat anestezi dozu uygulayarak hayvanı ötenazileştirin.
Tipik bir doz, 10 mg ketamin ve bir mg ksilazin içeren 200 mikrolitre PBS'dir. Pedal refleksini inceleyerek uyarana tam yanıt eksikliğini onaylayın. Göze tam erişime izin vermek için fareyi yanal yassılığa yerleştirin.
Bir Colibri dikiş forseps, kavisli forseps, 15 derece üç milimetre boyutunda bir mikro bıçak, yaylı mikro makas ve açılı bir yaylı mikro makası prosedür için hazır bulundurun. Göz küresinin etrafına kavisli bir forseps yerleştirin ve gözü yabancı ataşmanlardan kurtarmak için çimdikleyin. Niktitasyon zarı olarak da bilinen üçüncü göz kapağı, nazal teğetin üst köşesine doğru yerleştirilir ve pigmentli sınırları olan küçük bir yarı saydam çıkıntı olarak tanımlanabilir.
Ardından, bir yay mikro makası kullanın ve göz küresinin etrafını kesin. Küçük, sürekli kesikler göz küresini skleral ataşmanlardan serbest bırakır. Optik siniri keserek gözü serbest bırakmak için göz küresinin altına kavisli bir yay mikro makası yerleştirin.
Enüklee olmuş gözü, PBS tamponu içeren bir Petri kabına, göz küresi PBS'ye batırılacak şekilde yerleştirin. Bazı ekstraoküler kaslar veya dokular göz küresinden uzaklaşmaya başlayacaktır. Yaylı mikro makas kullanarak göz küresini keserek çıkarın.
Ardından, tüm hazırlıklar için retinanın daha iyi ayrılmasını sağlamak için optik siniri göz küresinin tabanından çıkarın. Doku kesiti için optik sinirin çıkarılması gerekli değildir. Göz küresini bir ml% 4 paraformaldehit veya PFA içeren 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın.
Doku fiksasyonu için iki saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Bu adımda dokuyu PFA'da dört santigrat derecede 12 saate kadar bırakarak duraklamak mümkündür. Ancak canlı hücrelerin izolasyonu için fiksasyon adımlarının yapılmaması ve tüm prosedürün süreklilik içinde yapılması gerekmektedir.
PFA fiksasyonundan sonra, göz küresini PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve sonraki prosedürü gerçekleştirmek için diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Colibri dikiş forsepsleri ile üçüncü göz kapağını sıkıca tutarak göz küresini hareketsiz hale getirin. Limbus kornea skleral kavşağıdır.
Bir mikrobıçak kullanarak delerek limbusta küçük bir kesi yapın. Kesi tercihen üçüncü göz kapağının karşısında yapılır. Daha sonra, bu insizyonu bir başlangıç noktası olarak kullanarak, mikro makas ile bu kornea skleral limbus çevresi boyunca küçük ve sürekli kesikler yapın.
İlk olarak, kesi noktasından başlayarak üçüncü göz kapağına kadar yarım daire şeklinde bir kesik tamamlayın. Ardından diğer taraftaki yarım daire şeklindeki kesimleri tamamlayın. Son olarak, arka ve ön fincanı ayırmak için üçüncü göz kapağının etrafında bir kesim yapın.
Nöral retina ve RPE tabakası ile kornea ön kapağından oluşan posterior fincanı elde etmek için forseps kullanarak lensi posterior fincandan çıkarın. Sabit olmayan dokularla çalışıyorsanız, ön ve arka kaplar artık kornea veya retinal tek hücreli süspansiyon elde etmek için enzimatik olarak sindirilebilir. Dokuları sabitlemek için, bu bardakları dört santigrat derecede 12 saat boyunca 1 ml% 4 PFA içeren 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın.
Fiksasyon sonrası doku uygun ortama gömülebilir ve kornea veya retina kesitleri elde etmek için kriyoseksiyon veya parafin kesitleme yapılabilir. Arka kabı PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar yerleştirin. Pigmentli RPE tabakası üzerindeki opak bir tabaka nöral retinadır.
İkinci bir forseps kullanarak nöral retinayı soyun. Dokuya zarar vermemek için çok yumuşak ve hafif bir el hareketi şiddetle tavsiye edilir. Optik sinirde, çıkışta, kavisli yay makası nöral retinanın altına yerleştirilebilir ve nöral retina bağlı kalırsa katmanları tamamen serbest bırakmak için bir kesim yapılabilir.
Retina ayrıca yumuşak bir fırça ile hafifçe okşayarak serbest bırakılabilir veya ayrılabilir. Ön ve arka kapları PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar yerleştirin. Üçüncü göz kapağının yanında, periferiden optik merkeze dik olarak bir kesim yapmak için açılı bir yaylı mikro makas kullanın.
Üçüncü göz kapağını tutun ve ilk kesimin yanında bir kesim yapın. İkinci kesim ile üçüncü göz kapağı arasında benzer bir kesim yapın. Bu tür üç veya dört eşit mesafeli kesim, yarım küre bardaklarını düz düşen ve kolayca monte edilebilen bir çiçek şekline açar.
Bardağın ortasına kadar çok derin kesimler yapmayın, çünkü bu yaprak bölümlerinin kolayca parçalanmasına veya ayrılmasına neden olabilir. Sıvı ortam, ön vizör adaptörünün kavisli bir yapıya kavuşmasını sağlar. Ön fincanda üç veya dört eşit mesafeli kesim yapmak için arka bardakta kesikler yapmak için verilen adımları izleyin.
Dokular artık daha fazla boyama için hazırdır. Bu şekilde, ön kabın bütünü gösterilmiştir. Kornea dokusu, kornea broşürünün bağlı konjonktival dokusundaki lenfatik damarları ortaya çıkarmak için tarif edildiği gibi mikrodisseke edildi.
Bu şekilde, nöral retinanın bütünü gösterilmiştir. Nöral retinanın retinal vaskülatürü İzolektin ile boyanmıştır ve yeşil damarlar olarak görülebilir. Bu yöntemde, farelerin enüklee göz küresi, etkili ve kolay kullanım için takılı üçüncü göz kapağı ile elde edilir.
Üçüncü göz kapağı göz küresini tamamen hareketsiz hale getirir ve diseksiyonun kolaylıkla ve minimum hatayla ilerlemesini sağlar. Bu yöntem oküler dokuya özgü kesitleme, tek hücreli analiz ve bütünlük için avantajlıdır. Bununla birlikte, tekrarlayan doku fiksasyonuna duyulan ihtiyaç, dokuyu hücre kültürü veya bu tür canlı hücre ihtiyaçları için dayanılmaz hale getirir.
Bu nedenle, canlı hücre izolasyonu için prosedürün süreklilik içinde yapılması gerekir.
