我们详细介绍了使用细胞外指标和胶原蛋白指标建立 3D 系统的方案，用于分析通过成骨形成和基因表达。细胞外指标可以增加胶原蛋白单形式凝胶的透明度，适用于探索枝晶形成的成像技术。首先，缓慢地将 0.9 毫升基底膜基质移入冰上新的 15 毫升离心管中，并将其放在一边。
接下来，从培养箱中取出 4 毫升补充有干扰素 γ 的完全培养基中的 IDG SW3 培养细胞的 T25 牙线。取出培养基后，用移液管用PBS pH 7.4洗涤细胞。然后用 0.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度下对细胞进行胰蛋白酶处理 30 秒。
通过添加 3.5 毫升完全培养基灭活胰蛋白酶。将4毫升的摄氏养老金转移到15毫升离心管中。在4摄氏度下以300G旋转细胞悬液5分钟。
弃去上清液后，将细胞调色板重悬于冰上一毫升完全培养基中。使用血细胞仪对细胞进行计数，并用完全培养基将最终细胞密度调整为每毫升 10 至第五个细胞的四倍。将0.1毫升制备的细胞悬液添加到保持在冰上的0.9毫升细胞外基质中。
轻轻上下移液，充分混合。通过在冰上上下移液，轻轻混合一毫升细胞基质混合物和一毫升先前制备的胶原蛋白。将 0.5 毫升最终混合物移液到 24 孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时以形成细胞凝胶混合物。
孵育后，在每个孔的细胞凝胶混合物中加入 0.5 毫升成骨培养基。要在 37 摄氏度时开始成骨分化，请将其视为第 0 天。每两天，用新鲜的成骨培养基替换一半的培养基，并继续培养35天。
从冰箱中取出钙AM和乙锭一储备溶液，让它们加热至室温。将 4 微升 2 毫摩尔乙锭 1 储备溶液和 5 微升 4 毫摩尔钙 AM 储备溶液加入 2 毫升 DPBS 中，充分混合，得到 2 微摩尔钙 AM 和 4 微摩尔乙锭 1 作为工作溶液。为了在培养的第 1 天和第 7 天进行细胞染色，将 0.5 毫升工作溶液移入 24 孔板的孔中，并在室温下孵育 30 至 45 分钟以对细胞凝胶基质进行染色。
将大约 0.5 毫升新鲜的 DPBS 添加到新的 35 毫米玻璃底培养皿中，并盖住培养皿以防止样品污染或干燥。使用肘尖镊子，小心地将染色的细胞凝胶基质转移到含有DPBS的培养皿中，而不会损坏或剪切细胞凝胶基质。在激光共聚焦荧光显微镜下观察标记的细胞。
将含有染色细胞凝胶基质的培养皿放在显微镜载物台上。使用 10 倍物镜选择要通过目镜扫描的细胞凝胶基质区域。要设置显微镜扫描，请选择滤光片。
使用标准荧光带通滤光片将钙视为绿色，使用碘化丙啶或德克萨斯红色染料滤光片将乙锭视为红色。选择用于扫描的线模式，然后单击采集模式将通风单位设置为 1 au。选择 8 位数据深度和 1024 x 1024 像素的图像分辨率。
然后选择行步长并将扫描速度设置为五。要收集Z轴图像堆栈，请通过聚焦样品来定义要扫描的细胞凝胶基质的顶部和底部位置，同时根据绿色通道信号进行连续扫描。指定样品的顶部和底部后，选择所需的扫描框并开始扫描。
使用选定的设置从上到下扫描样品，生成图像库。要识别活细胞，请选择一个图像切片。绿色和红色通道分别表示活细胞和死细胞。
为了识别细胞树突，选择单个绿色通道，用图像采集软件生成3D重建，一系列彩虹伪彩色图像指示深度信息。她底部的树突显示为红色，而顶部的树突显示为蓝色。在培养的不同日子里，取出培养基并用DPBS洗涤板中的凝胶两次。
向孔中加入0.5毫升或4%多聚甲醛的DPBS溶液，使细胞凝胶基质在室温下固定在板中10分钟。如前所述，去除孔中的多聚甲醛，并用板中的DPBS再洗涤细胞凝胶基质两次，并在每个孔中留下0.5毫升DPBS用于成像。将板放在立体显微镜载物台上，并使用0.5倍物镜通过目镜选择最佳位置。
图像，在明场下使用自动曝光的板中细胞凝胶基质的全场视图。在培养的第35天，检查液氮水平并启动XRF系统。打开样品室，用肘尖镊子将凝胶从板转移到仪器样品台的中间。
关闭样品室并等待 30 分钟，让仪器冷却后再使用。将曝光时间设置为 35 毫秒。光谱范围为零至40千电子伏特，电流为770微安，用于采集设置。
移动样品台，选择三到五个扫描位点进行分析。选择元素钙和磷。开始检测并导出结果。
在不同的培养日子里。如前所述，用冰冷的DPBS洗涤去除细胞凝胶基质的培养基两次。使用苯酚氯仿异戊醇法从细胞凝胶基质中提取总RNA。
然后用随机六聚体引物将两微克总 RNA 逆转录为 CDNA。将试管放在热循环仪上并进行PCR扩增。PCR后，用两个delta CT方法分析倍数变化。
在共聚焦激光显微镜下可视化的活死细胞染色显示，所有细胞均为钙AM阳性，几乎没有乙锭一阳性细胞，表明凝胶系统非常适合骨细胞生成。到第七天，细胞树突逐渐延伸到成骨培养基中的网络。第七天培养物的伪彩色图像显示了凝胶底部和顶部不同深度的细胞机器人。
在指定时间对24孔板中含有细胞的凝胶和不含细胞的凝胶的全场图像进行成像。与无细胞凝胶基质不同，凝胶基质的透明度继续下降，直到第 35 天变得不透明。第35天不透明凝胶的XRF光谱表明，凝胶中完全充满了钙和磷沉积物。
实时荧光定量PCR分析了多个标记基因的表达，从第1天到第21天，鬼臼蛋白和牙本质基质蛋白1的mRNA水平持续升高，第21天后mRNA水平下降。成纤维细胞生长因子 23 和硬化蛋白的 mRNA 水平在所有阶段持续升高。胶原蛋白一和基底膜指标在室温下快速凝胶。
因此，除非另有说明，否则所有使用的吸头和管子都必须预冷。人们可以通过成像技术观察成骨过程中任何有趣的事件。在树突形成和伸长过程中更容易定位分子作用。
