Nós detalhamos um protocolo para estabelecer um sistema 3D usando uma métrica extracelular juntamente com uma de colágeno para analisar a formação e expressão gênica através da osteogênese. Métricas extracelulares podem aumentar a transparência do gel de forma única de colágeno e é adequado para explorar a formação de dendritos para técnicas de imagem. Para começar lentamente, pipetar 0,9 mililitros de matriz de membrana basal em um novo tubo centrífugo de 15 mililitros no gelo e mantê-lo de lado.
Em seguida, remova um fio dental T25 de células IDG SW3 cultivadas em quatro mililitros de meio completo suplementado com interferon gama da incubadora. Após a remoção do meio de cultura, lavar as células com PBS pH 7,4 com uma pipeta. Em seguida, tripsanizar as células com 0,5 mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por 30 segundos.
Inative a tripsina adicionando 3,5 mililitros de meio completo. Transfira quatro mililitros da pensão Celsius para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Gire a suspensão da célula a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda a paleta celular em um mililitro do meio completo sobre gelo. Contar as células usando um hemocitômetro e ajustar a densidade celular final com o meio completo para quatro vezes 10 a quinta células por mililitro. Adicionar 0,1 mililitros da suspensão celular preparada aos 0,9 mililitros da matriz extracelular mantida no gelo.
Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Misture suavemente um mililitro da mistura de matriz celular e um mililitro do colágeno previamente preparado, pipetando para cima e para baixo no gelo. Pipetar 0,5 mililitros da mistura final em cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius por uma hora para formar uma mistura de gel celular.
Após a incubação, adicionar 0,5 mililitros de meio osteogênico à mistura de gel celular em cada poço. Para iniciar a diferenciação osteogênica a 37 graus Celsius, considere isso como dia zero. A cada dois dias, substituir metade do meio por meio osteogênico fresco e continuar a cultura por 35 dias.
Retire as soluções estoque de cálcio AM e etídio do congelador e deixe aquecer até a temperatura ambiente. Adicione quatro microlitros de dois milimolares de etídio, uma solução estoque e cinco microlitros da solução estoque de quatro milimolares de cálcio AM a dois mililitros de DPBS e misture bem para obter dois AM de cálcio micromolar e quatro de etídio micromolar como solução de trabalho. Para realizar a coloração celular no primeiro e no sétimo dia de cultivo, pipetar 0,5 mililitros da solução de trabalho nos poços da placa de 24 poços e incubar por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente para manchar a matriz de gel celular.
Adicione aproximadamente 0,5 mililitros de DPBS fresco a um novo prato de cultura com fundo de vidro de 35 milímetros e cubra o prato para evitar contaminação ou secagem das amostras. Usando pinça com ponta de cotovelo, transfira cuidadosamente a matriz de gel de células coradas para a placa de cultura contendo DPBS sem danificar ou cisalhar a matriz de gel celular. Visualize as células marcadas sob um microscópio confocal de fluorescência a laser.
Coloque a placa de cultura contendo a matriz de gel de células coradas no palco do microscópio. Selecione as regiões da matriz de gel celular a serem escaneadas através da ocular usando uma objetiva de 10x. Para definir a varredura do microscópio, selecione os filtros ópticos.
Veja o cálcio como verde com um filtro de passagem de banda fluorescente padrão e o etídio como vermelho com filtros para iodeto de propídio ou corante vermelho do Texas. Selecione o modo de linha para digitalização e, em seguida, clique no modo de aquisição para definir as unidades arejadas como uma UA. Selecione a profundidade de dados de 8 bits e uma resolução de imagem de 1024 por 1024 pixels.
Em seguida, selecione a etapa de linha e defina a velocidade de varredura como cinco. Para coletar a pilha Z de imagens, defina as posições superior e inferior da matriz de gel celular a ser escaneada, focalizando através da amostra enquanto escaneia continuamente de acordo com o sinal do canal verde. Depois que a parte superior e inferior da amostra tiverem sido especificadas, selecione o quadro de digitalização desejado e inicie a digitalização.
A amostra é digitalizada de cima para baixo com as configurações selecionadas gerando uma galeria de imagens. Para identificar as células viáveis, selecione uma fatia de imagem. Os canais verde e vermelho indicam células vivas e mortas, respectivamente.
Para identificar o dendrito celular, selecione o único canal verde para gerar reconstruções 3D com o software de aquisição de imagens, uma série de imagens pseudocoloridas do arco-íris indicam as informações de profundidade. Os dendritos na parte inferior são exibidos em vermelho, enquanto os da parte superior são exibidos em azul. Em dias diferentes de cultivo, retire o meio de cultura e lave os géis na placa duas vezes com DPBS.
Adicione 0,5 mililitros ou paraformaldeído a 4% em DPBS ao poço para fixar a matriz de gel celular na placa por 10 minutos à temperatura ambiente. Retire o paraformaldeído no poço e lave a matriz de gel celular mais duas vezes com DPBS na placa, como demonstrado anteriormente, e deixe 0,5 mililitros de DPBS em cada poço para obtenção de imagens. Coloque a placa no estágio do microscópio estéreo e selecione a posição ideal através da ocular usando uma objetiva de 0,5x.
Imagem, a visão de campo completo da matriz de gel celular na placa individualmente usando exposição automática sob o campo brilhante. No 35º dia de cultivo, verifique os níveis de nitrogênio líquido e inicie o sistema de FRX. Abra a sala de amostras e transfira os géis com pinça com ponta de cotovelo da placa para o meio do estágio de amostra do instrumento.
Feche a sala de amostras e aguarde 30 minutos para deixar o instrumento esfriar antes de usar. Defina o tempo de exposição para 35 milissegundos. O espectro varia de zero a 40 quilo elétron-volts e a corrente elétrica a 770 microamperes para aquisição configurada.
Movendo o estágio de amostragem, escolha de três a cinco locais de varredura para análise. Selecione os elementos cálcio e fósforo. Inicie a detecção e exporte os resultados.
Em dias diferentes de cultivo. Lavar duas vezes a matriz de gel celular removida do meio de cultura com DPBS gelada, conforme demonstrado anteriormente. Extrair o RNA total da matriz do gel celular usando o método do álcool isoamílico clorofórmio fenol.
Em seguida, transcreva reversamente dois microgramas de RNA total para CDNA com iniciadores hexâmeros aleatórios. Coloque o tubo em um termociclador e realize a amplificação por PCR. Após a PCR analise as alterações de dobra com o método de TC de dois deltas.
A coloração de células mortas vivas, visualizada em microscópio confocal a laser, mostrou que todas as células eram positivas para AM de cálcio e quase nenhuma célula positiva para etídio, indicando que o sistema gel é altamente adequado para osteocitogênese. Os dendritos celulares gradualmente se estenderam em uma rede no meio osteogênico até o sétimo dia. Uma pseudo imagem colorida da cultura do dia sete exibe os androides celulares em diferentes profundidades na parte inferior e na parte superior do gel.
Imagens de campo completo do gel com células e gel sem células em uma placa de 24 poços nos tempos indicados são fotografadas. A transparência da matriz de gel continuou a declinar até se tornar opaca aos 35 dias, ao contrário da matriz de gel livre de células. O espectro de XRF do gel opaco no 35º dia indicou que o gel estava completamente preenchido com depósitos de cálcio e fósforo.
A expressão de vários genes marcadores analisados por PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm da podoplanina e da proteína da matriz de dentina um aumentaram continuamente do primeiro dia até o dia 21 e o nível de RNAm diminuiu após o dia 21. Os níveis de RNAm do fator de crescimento de fibroblastos 23 e da esclerostina aumentaram continuamente durante todos os estágios. O colágeno um e a membrana basal medem o gel rapidamente e a temperatura ambiente.
Por conseguinte, todas as pontas e tubos utilizados devem ser pré-refrigerados, salvo indicação em contrário. Pode-se observar quaisquer eventos interessantes durante a osteogênese por técnicas de imagem. É mais fácil localizar a ação da molécula durante a formação e alongamento dos dendritos.
