Detallamos un protocolo para establecer un sistema 3D utilizando una métrica extracelular junto con una de colágeno para analizar la formación y expresión génica a través de la osteogénesis. La métrica extracelular puede aumentar la transparencia del gel de colágeno de una forma y es adecuado para explorar la formación de dendritas para técnicas de imagen. Para comenzar, pipetee lentamente 0,9 mililitros de matriz de membrana basal en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros sobre hielo y déjelo a un lado.
A continuación, retire de la incubadora un hilo dental T25 de células cultivadas con IDG SW3 en cuatro mililitros de medio completo suplementado con interferón gamma. Después de retirar el medio de cultivo, lave las células con PBS pH 7,4 con una pipeta. A continuación, tripsanar las células con 0,5 mililitros de tripsina EDTA al 0,25% a 37 grados centígrados durante 30 segundos.
Inactiva la tripsina añadiendo 3,5 mililitros de medio completo. Transfiera cuatro mililitros de la pensión Celsius a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender la paleta celular en un mililitro del medio completo en hielo. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la densidad celular final con el medio completo a cuatro veces 10 a la quinta célula por mililitro. Añadir 0,1 mililitros de la suspensión celular preparada a los 0,9 mililitros de la matriz extracelular mantenida en hielo.
Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Mezcle suavemente un mililitro de la mezcla de matriz celular y un mililitro de la mezcla de colágeno previamente preparada pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el hielo. Pipetear 0,5 mililitros de la mezcla final en cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar a 37 grados centígrados durante una hora para formar una mezcla de gel celular.
Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de medio osteogénico a la mezcla de gel celular en cada pocillo. Para iniciar la diferenciación osteogénica a 37 grados Celsius, considéralo como el día cero. Cada dos días, reemplace la mitad del medio con medio osteogénico fresco y continúe el cultivo durante 35 días.
Retire las soluciones madre de calcio AM y etidio del congelador y deje que se calienten a temperatura ambiente. Agregue cuatro microlitros de los dos milimolares de etidio una solución madre y cinco microlitros de la solución madre de cuatro milimolares de calcio AM a dos mililitros de DPBS y mezcle bien para obtener dos micromolares de calcio AM y cuatro micromolares de etidio como solución de trabajo. Para realizar la tinción celular en el primer y séptimo día de cultivo, pipetee 0,5 mililitros de la solución de trabajo en los pocillos de la placa de 24 pocillos e incube durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente para teñir la matriz de gel celular.
Agregue aproximadamente 0,5 mililitros de DPBS fresco a una nueva placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros y cubra la placa para evitar la contaminación o el secado de las muestras. Con pinzas con punta de codo, transfiera con cuidado la matriz de gel celular teñida a la placa de cultivo que contiene DPBS sin dañar ni cortar la matriz de gel celular. Observe las células marcadas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal.
Coloque la placa de cultivo que contiene la matriz de gel celular teñida en la platina del microscopio. Seleccione las regiones de la matriz de gel celular que se escanearán a través del ocular con un objetivo de 10x. Para configurar el escaneo del microscopio, seleccione los filtros ópticos.
Vea el calcio como verde con un filtro de paso de banda fluorescente estándar y el de etidio como rojo con filtros para yoduro de propidio o tinte rojo de Texas. Seleccione el modo de línea para escanear, luego haga clic en el modo de adquisición para establecer las unidades aireadas en una au. Seleccione una profundidad de datos de 8 bits y una resolución de imagen de 1024 por 1024 píxeles.
A continuación, seleccione el paso de línea y establezca la velocidad de escaneo en cinco. Para recopilar la pila Z de imágenes, defina las posiciones superior e inferior de la matriz de gel celular que se escaneará enfocándose a través de la muestra mientras escanea continuamente de acuerdo con la señal del canal verde. Una vez que se hayan especificado la parte superior e inferior de la muestra, seleccione el marco de escaneo deseado y comience a escanear.
La muestra se escanea de arriba a abajo con la configuración seleccionada generando una galería de imágenes. Para identificar las células viables, seleccione un sector de imagen. Los canales verde y rojo indican células vivas y muertas respectivamente.
Para identificar la dendrita celular, seleccione el único canal verde para generar reconstrucciones 3D con el software de adquisición de imágenes, una serie de imágenes de pseudo color del arco iris indican la información de profundidad. Las dendritas en la parte inferior de ella se muestran en rojo, mientras que las de la parte superior se muestran en azul. En diferentes días de cultivo, retire el medio de cultivo y lave los geles en la placa dos veces con DPBS.
Agregue 0,5 mililitros o 4% de paraformaldehído en DPBS al pocillo para fijar la matriz de gel celular en la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el paraformaldehído en el pocillo y lave la matriz de gel celular dos veces más con DPBS en la placa como se demostró anteriormente, y deje 0,5 mililitros de DPBS en cada pocillo para obtener imágenes. Coloque la placa en la platina del microscopio estereoscópico y seleccione la posición óptima a través del ocular con un objetivo de 0,5x.
Imagen, la vista de campo completo de la matriz de gel celular en la placa individualmente utilizando la exposición automática bajo el campo brillante. En el día 35 de cultivo, verifique los niveles de nitrógeno líquido e inicie el sistema XRF. Abra la sala de muestras y transfiera los geles con pinzas con punta de codo desde la placa hasta el centro de la etapa de muestra del instrumento.
Cierre la sala de muestras y espere 30 minutos para que el instrumento se enfríe antes de usarlo. Ajuste el tiempo de exposición a 35 milisegundos. El rango de espectro de cero a 40 kilo electronvoltios y la corriente eléctrica a 770 microamperios para la configuración de adquisición.
Al mover la etapa de la muestra, elija de tres a cinco sitios de escaneo para el análisis. Seleccione los elementos calcio y fósforo. Inicie la detección y exporte los resultados.
En diferentes días de cultivo. Lave el medio de cultivo y la matriz de gel celular extraída dos veces con DPBS helado como se demostró anteriormente. Extraiga el ARN total de la matriz de gel celular utilizando el método de fenol cloroformo isoamílico.
A continuación, transcriba inversamente dos microgramos de ARN total a ADNc con cebadores hexámeros aleatorios. Coloque el tubo en un termociclador y realice la amplificación por PCR. Después de la PCR, analice los cambios en el pliegue con el método de TC de dos deltas.
La tinción de células muertas vivas visualizada bajo un microscopio láser confocal mostró que todas las células eran positivas para calcio AM y casi ninguna célula positiva para el epidio uno, lo que indica que el sistema de gel es muy adecuado para la osteocitogénesis. Las dendritas celulares se extendieron gradualmente en una red en el medio osteogénico hacia el séptimo día. Una imagen pseudo en color de la cultura del día siete muestra a los androides celulares a diferentes profundidades en la parte inferior y en la parte superior del gel.
Se obtienen imágenes de campo completo del gel con células y del gel sin células en una placa de 24 pocillos en los momentos indicados. La transparencia de la matriz de gel continuó disminuyendo hasta que se volvió opaca en el día 35, a diferencia de la matriz de gel libre de células. El espectro XRF del gel opaco en el día 35 indicó que el gel estaba completamente lleno de depósitos de calcio y fósforo.
La expresión de varios genes marcadores analizados por PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de podoplanina y proteína de matriz de dentina uno aumentaron continuamente desde el primer día hasta el día 21 y el nivel de ARNm disminuyó después del día 21. Los niveles de ARNm del factor de crecimiento de fibroblastos 23 y la esclerostina aumentaron continuamente durante todas las etapas. El colágeno uno y las métricas de la membrana basal se gelifican rápidamente y a temperatura ambiente.
Por lo tanto, todas las puntas y tubos utilizados deben estar preenfriados a menos que se indique lo contrario. Se puede observar cualquier evento interesante durante la osteogénesis mediante técnicas de imagen. Es más fácil localizar la acción de la molécula durante la formación y elongación de las dendritas.
